Un agonista optimizado de Nurr1 proporciona enfermedad

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4283 (2023) Citar este artículo

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El receptor nuclear, Nurr1, es fundamental tanto para el desarrollo como para el mantenimiento de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, lo que representa un objetivo molecular prometedor para la enfermedad de Parkinson (EP). Anteriormente identificamos tres agonistas de Nurr1 (amodiaquina, cloroquina y glafenina) que comparten una estructura química idéntica, 4-amino-7-cloroquinolina (4A7C), lo que sugiere una relación estructura-actividad. En este documento informamos una búsqueda sistemática de química medicinal en la que se generaron y caracterizaron más de 570 derivados de 4A7C. Múltiples compuestos mejoran la actividad transcripcional de Nurr1, lo que lleva a la identificación de un agonista optimizado de penetración cerebral, 4A7C-301, que exhibe potentes efectos neuroprotectores in vitro. Además, 4A7C-301 protege las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo en el modelo de EP de ratón macho inducido por MPTP y mejora los déficits olfativos tanto motores como no motores sin comportamientos similares a los de la discinesia. Además, 4A7C-301 mejora significativamente las anomalías neuropatológicas y mejora las disfunciones motoras y olfativas en modelos de ratones macho que sobreexpresan α-sinucleína mediada por AAV2. Estas propiedades modificadoras de la enfermedad del 4A7C-301 pueden justificar la evaluación clínica de este o compuestos análogos para el tratamiento de pacientes con EP.

La enfermedad de Parkinson (EP), que afecta al 2-3% de la población mayor de 65 años, es el segundo trastorno neurodegenerativo más común, después de la enfermedad de Alzheimer1,2,3. La degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo (mDAN) en la sustancia negra y la acumulación y agregación neurotóxica de α-sinucleína (αSyn) en los cuerpos de Lewy son características patológicas distintivas de la EP. Se cree que la manifestación de la EP es causada por la acción combinada de factores genéticos y ambientales a través de múltiples vías de interacción que incluyen disfunción mitocondrial, estrés oxidativo, neuroinflamación y degradación/autofagia desregulada de proteínas3,4,5,6,7. Actualmente, la terapia de reemplazo de dopamina (DA) (p. ej., L-DOPA) es el tratamiento estándar de oro. Si bien mejora significativamente la calidad de vida de los pacientes con EP, la ventana terapéutica sin efectos secundarios inaceptables, como la discinesia, y el grado de beneficio disminuyen con el tiempo8,9, y no existe ningún tratamiento que pueda detener o retardar la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, existe una gran necesidad insatisfecha de desarrollar nuevos tratamientos modificadores de la enfermedad para la EP10,11.

Durante las últimas décadas, las cascadas reguladoras transcripcionales de los mDAN se han estudiado exhaustivamente12. Dos vías principales de desarrollo de mDAN (es decir, Sonic hedgehog-FoxA2 y Wnt1-Lmx1A) convergen para inducir Nurr113,14,15, destacando a Nurr1 como un regulador maestro para mDAN. De hecho, los estudios de eliminación de Nurr1 (KO) y KO condicional en ratones demostraron que Nurr1 es esencial no solo para el desarrollo16 sino también para el mantenimiento de mDAN adultos17. Además, se demostró que Nurr1 protege los mDAN de la muerte inducida por neuroinflamación al suprimir la expresión de genes proinflamatorios neurotóxicos4. Además, se ha informado que la expresión de Nurr1 está significativamente disminuida en el cerebro de pacientes con EP tanto ancianos como esporádicos18,19,20.

Nurr1 pertenece a la subfamilia del receptor nuclear NR4A, lo que sugiere que su función de transcripción puede ser modulada por ligandos sintéticos y/o endógenos21. Además, Nurr1 puede funcionar como activador transcripcional y como represor, dependiendo del contexto celular (p. ej., en mDANs16 y microglia4, respectivamente). Para comenzar a abordar si Nurr1 podría ser un objetivo molecular para el tratamiento modificador de la enfermedad de PD22, establecimos sistemas de ensayo de alto rendimiento y previamente analizamos una biblioteca de medicamentos aprobados por la FDA de EE. UU. Identificamos tres fármacos, es decir, amodiaquina (AQ), cloroquina (CQ) y glafenina, que mejoran significativamente la actividad transcripcional de Nurr1 mediante la unión directa a su dominio de unión a ligando (LBD)23. Los tres fármacos compartían una estructura química idéntica. 4-amino-7-cloroquinolina (4A7C), lo que nos lleva a plantear la hipótesis de que este motivo 4A7C representa una relación estructura-actividad (SAR) que podría usarse para identificar mejores derivados de 4A7C con mayor potencia y menores efectos secundarios a través de medicamentos basados ​​en SAR. química24. En línea con esta hipótesis, trabajos recientes de Muñoz-Tello et al. 25 y Willems et al. 26,27 mostraron que AQ y CQ y sus derivados pueden funcionar como agonistas de Nurr1. Willems et al. 26 también informaron que la eliminación del grupo 7-cloro o 4-amino del farmacóforo 4A7C conduce a la pérdida de actividad, lo que respalda aún más nuestra hipótesis de que 4A7C es un farmacóforo válido para diseñar potentes agonistas de Nurr1. Con este fin, realizamos un esfuerzo sistemático de química medicinal utilizando CQ como compuesto inicial porque es relativamente seguro y todavía se usa ampliamente para tratar enfermedades humanas como la malaria y las enfermedades autoinmunes28. Caracterizamos múltiples (>570) derivados de 4A7C mediante ensayos bioquímicos, moleculares y celulares e identificamos un candidato final, 4A7C-301, que exhibe una potencia considerablemente mayor y proporciona efectos neuroprotectores basados ​​en mecanismos en modelos de EP tanto in vitro como in vivo. , utilizando por separado modelos de factores de riesgo de EP tanto ambientales (el inhibidor del complejo mitocondrial I 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+)) como genéticos (αSyn). A diferencia de L-DOPA o CQ, 4A7C-301 mejoró significativamente las disfunciones motoras y no motoras sin efectos secundarios como comportamientos similares a la discinesia o inhibición de la autofagia. Nuestros datos demuestran una prueba de principio de que los agonistas optimizados de Nurr1 pueden proporcionar un tratamiento modificador de la enfermedad tanto para la EP esporádica como para la familiar.

Anteriormente, nuestro grupo diseñó y sintetizó potentes híbridos antipalúdicos activos contra cepas de P. falciparum resistentes a los medicamentos29,30,31,32. Estos híbridos se basaron en unir el farmacóforo 4A7C a otros farmacóforos antipalúdicos (como triazinas/pirimidinas) a través de un conector de cadena alquílica flexible, similar al de CQ. Especulamos que algunos de estos derivados de 4A7C activarían la función de transcripción de Nurr1, si 4A7C es un SAR válido. De hecho, utilizando nuestros ensayos de indicador Nurr1 establecidos23,33, encontramos que ~20% de estos derivados exhibieron una activación detectable de la función Nurr1. También observamos que cuando el farmacóforo 4A7C está unido a una triazina sustituida o un anillo de pirimidina, mostró una activación prominente de Nurr1 (EC50/inducción máxima de veces hasta 1,10 µM/4,76 veces para 4A7C-triazinas y hasta 121,22 nM/5,08 veces para pirimidinas 4A7C, ver Fig. 1a). El híbrido 4A7C-pirimidina 4A7C-101 surgió como el primer compuesto líder que activa Nurr1 con un valor de EC50 más bajo (121,22 nM) que CQ (50,25 µM) y se seleccionó para una mayor optimización (Fig. 1a; Tabla complementaria 1). Luego se llevó a cabo un programa exhaustivo de optimización de clientes potenciales para evaluar los efectos de las modificaciones estructurales en los tres sitios de modificación principales de 4A7C-101 (Fig. 1b), lo que resultó en la generación de derivados de 4A7C adicionales (~ 470). Este análisis de SAR reveló puntos importantes para una mayor optimización de los derivados de pirimidina 4A7C (ver Fig. 1b). En primer lugar, para el conector, un conector de cadena diamino alifática (C2-C3) flexible y corto que conecta el 4A7C al anillo de pirimidina mostró buena actividad. Cuando se usó piperazina como conector (rígido, sin -NH libre en la cuarta posición de la quinolina), se perdió actividad, lo que indica la esencialidad del grupo 4-amino del anillo de quinolina. El otro –NH del conector (que une el anillo de pirimidina) puede sustituirse o incluso eliminarse, conservando la actividad. Los compuestos con sustituyente –CH2-1,3-benzodioxol o –CH2-tiofeno mostraron buena actividad (véanse los compuestos 4A7C-501 a 4A7C-508 en la Tabla complementaria 1). Un conector híbrido de cadena alifática-piperazina también mostró buena potencia (véanse los compuestos 4A7C-201 a 4A7C-208 en la Tabla complementaria 1). La sustitución del –OH de la amodiaquina por –F para formar fluoro-amodiaquina-pirimidinas condujo a la pérdida de actividad, lo que indica la importancia del grupo hidroxilo fenólico de la AQ para la actividad de Nurr1 (que también está de acuerdo con Merk et al. 26). En segundo lugar, para el anillo de pirimidina, la regioquímica de la pirimidina también juega un papel en la actividad, pero la actividad depende de los sustituyentes en el anillo de pirimidina y el conector. Cuando se utilizó el anillo de quinazolina (una pirimidina fusionada) en lugar de pirimidina, la actividad se conservó, pero se observó una ligera caída. En tercer lugar, para los sustituyentes del anillo de pirimidina, los sustituyentes con grupo –NH libre (como los aminoalcoholes) disminuyeron la actividad y los sustituyentes de aminas carbocíclicas fueron importantes para una buena actividad. En algunos casos, las moléculas con sustituyentes -Cl (compuestos intermedios a finales) también mostraron actividad.

a, b Desarrollo de conjugados 4A7C-pirimidina como potentes agonistas de Nurr1 a partir de CQ basados ​​en la relación estructura-actividad (SAR) que comparten un andamio idéntico, 4-amino-7-cloroquinolina (4A7C; indicado en color rojo); (i), (ii), (iiia)/(iiib) indican los sitios de modificaciones estructurales en 4A7C-pirimidinas. c Esquema sintético para 4A7C-301; Condiciones de reacción: (i) puro, 120 °C, 8 h, 90 %; (ii) trietilamina, THF, 60 °C, 12 h, 28 % (5A), 53 % (5B); (iii) tubo limpio, sellado, 110 °C, 5 h, 65%. d, e Ensayos de luciferasa utilizando Nurr1-LBD (c) o Nurr1 de longitud completa (d) en células SK-N-BE(2)C. *P < 0,05, ****P < 0,0001 en comparación con el control (CTL), ANOVA de dos factores, prueba post hoc de Dunnett; n = 3 muestras biológicamente independientes por grupo. Los datos son media ± sem del ensayo de luciferasa que determina el efecto de CQ (100 µM) y 4A7C-301 (20 µM) usando LBD de miembros de la subfamilia NR4A en células SK-N-BE(2)C. Se utilizaron prostaglandina A1 (PGA1, 10 µM) y citosporona B (10 µM) como controles positivos de la activación de Nor1 y Nur77, respectivamente. n = 3 muestras biológicamente independientes por grupo. Los datos son media ± sem g del ensayo de luciferasa utilizando mutantes puntuales en posibles residuos de unión a Nurr1-LBD en células SK-N-BE(2)C. P < 0,0001 en comparación con CQ o 4A7C-301 de tipo salvaje (WT), ANOVA de dos vías, prueba post-hoc de Dunnett; n = 4 muestras biológicamente independientes por grupo. Los datos son media ± sem h Análisis de competencia de CQ o 4A7C-301 con [3H]-CQ para la unión a Nurr1-LBD. Se utilizó ácido retinoico (RA) como control negativo. n = 3 muestras biológicamente independientes por grupo. Los datos son media ± sdi, ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) que muestra una competencia dependiente de la dosis de CQ o 4A7C-301 con hidroxi-CQ marcado con fluorescencia (HCQFluo) para unirse a Nurr1-LBD. n = 3 muestras biológicamente independientes por grupo. Los datos son media ± DE

Se observó que los sustituyentes en el anillo de pirimidina tienen un efecto importante en la actividad general de Nurr1 de los derivados de pirimidina 4A7C y, por lo tanto, nos esforzamos aún más en optimizar los sustituyentes en el anillo de pirimidina. El compuesto 4A7C-102, análogo a 4A7C-101 pero que tiene un sustituyente de N-etilpiperazina en la posición 2 del anillo de pirimidina, fue el segundo mejor compuesto identificado hasta el momento (activación de 3,68 veces a CE50 de 143,13 nM). Luego consideramos la posibilidad de reemplazar el grupo –Me en la cuarta posición del anillo de pirimidina de 4A7C-101 con otros sustituyentes, inicialmente manteniendo constante el sustituyente de piperidina de 4A7C-101, para comprender su papel en la actividad de Nurr1. Los análogos de 4A7C-101 en los que el sustituyente –Me fue reemplazado por un sustituyente –Ph, un sustituyente –CF3, un sustituyente –Cl o un átomo –H mostraron una activación de Nurr1 disminuida. También estudiamos la influencia de un conector C2 más corto y la regioquímica de pirimidina y descubrimos que el compuesto 4A7C-103 con una regioquímica de pirimidina diferente y que tiene un sustituyente –Cl y un sustituyente de N-etil piperazina retenía una actividad Nurr1 disminuida. Además, el compuesto análogo 4A7C-104 que tiene un único punto de diferencia con respecto al conector C2 en lugar de un conector C3 mostró una mejor EC50 de Nurr1 que 4A7C-103 (consulte la Tabla 1 complementaria). A continuación, estudiamos la influencia de la disustitución con diferentes aminas cíclicas en las posiciones 4 y 6 del anillo de pirimidina y manteniendo la longitud de la cadena del conector de 2 carbonos (es decir, conector de 1,2-diaminoetano). Como primer paso, para comprender el efecto del tamaño del anillo y el volumen de las aminas cíclicas en la activación de Nurr1, la pirimidina se disustituyó con pirrolidina (anillo de 5 miembros), piperidina (anillo de 6 miembros) y azepano (anillo de 7 miembros). ). El compuesto sustituido con piperidin-1-ilo de 6 miembros 4A7C-302 mostró la activación máxima (5,19 veces a una CE50 de 950,63 nM). En el siguiente paso, se añaden otros sustituyentes cicloamina de 6 miembros, a saber. Se introdujeron morfolina, N-metilpiperazina y N-etilpiperazina como disustituyentes en el anillo de pirimidina. Entre ellos, se muestra 4A7C-301, cuyo punto de unión al conector es la segunda posición del anillo de pirimidina y tiene dos sustituyentes 4-etil-piperazin-1-ilo en las posiciones cuarta y sexta del anillo de pirimidina. la activación de Nurr1 más alta junto con un valor de EC50 significativamente más bajo en comparación con CQ. Su compuesto regiomérico 4A7C-303 también mostró buena actividad, pero con una inducción menor que 4A7C-301. También mantuvimos constante la actividad que imparte el sustituyente 4-etil-piperazin-1-ilo en la posición 4 y variamos los sustituyentes de amina cíclica en la posición 6 con piperidina, morfolina y N-metil-piperazina (derivados 4A7C-304, 4A7C-305 y 4A7C-306, respectivamente). Aunque estos derivados mostraron buenas actividades Nurr1 (en el orden: N-metilpiperazina > morfolina > piperidina, el derivado 4A7C-301 con mayor inducción (18,12 veces) y un valor de EC50 significativamente menor (6,53 µM) que CQ (50,25 µM). fue seleccionado como candidato preclínico para estudios adicionales (Fig. 1c; Tabla complementaria 1). La permeabilidad cerebral de 4A7C-301 se evaluó mediante análisis de plasma sanguíneo y homogeneizados de cerebro en diferentes momentos después de la administración oral en ratas SD (20 mg / kg ) 4A7C-301 penetró bien en el cerebro y se mantuvo constantemente en el cerebro (Figuras complementarias 1a-c).

Para evaluar la potencia de los derivados de 4A7C en la promoción de la actividad transcripcional de Nurr1, inicialmente utilizamos la línea celular de neuroblastoma humano SK-N-BE(2)C porque es ideal para la detección de alto rendimiento debido a su alta eficiencia de transfección23,33. 4A7C-301 aumentó las actividades transcripcionales tanto de Nurr1-LBD (Fig. 1d) como de Nurr1 de longitud completa (Fig. 1e) de una manera dependiente de la dosis, con una potencia mayor que CQ (EC50 fue 7-8 y 50-70 µM , respectivamente). Luego analizamos la selectividad de CQ y 4A7C-301 hacia otros miembros de la subfamilia NR4A (Nur77 y Nor1). Como se muestra en la Fig. 1f, en las células SK-N-BE (2) C, CQ y 4A7C-301 indujeron la actividad transcripcional de Nurr1 con la mayor potencia (13-14 veces) entre los miembros de NR4A. También encontramos que ambos compuestos activaron significativamente la actividad transcripcional de Nor1 pero con menor eficiencia (3-4 veces). Por el contrario, no activaron la actividad transcripcional de Nur77, mientras que el agonista de Nur77, la citosporona B34, la aumentó considerablemente. En conjunto, estos datos sugieren que CQ/4A7C-301 activa selectivamente la actividad transcripcional de Nurr1, pero no de Nur77, sobre Nor1. Aunque las células SK-N-BE(2)C expresan el gen de la tirosina hidroxilasa (TH), no son de origen mDAN. Por lo tanto, comparamos las potencias transcripcionales de 4A7C-301 y CQ en la línea celular dopaminérgica N27-A, que se originó a partir de mDAN de rata35,36. Sorprendentemente, 4A7C-301 exhibió una potencia aproximadamente 50 veces mayor que CQ en células N27-A (EC50 fue ~ 0,2 y ~ 10 µM, respectivamente; Fig. complementaria 1d, e). Para determinar si 4A7C-301 funciona interactuando con Nurr1-LBD, examinamos los efectos de mutaciones específicas de Nurr1-LBD en los residuos perturbados según nuestros estudios previos de titulación de RMN23,33,37. Aunque estos estudios demostraron que AQ23, CQ37 y PGA1/PGE133 interactúan con Nurr1-LBD, los residuos específicos que interactúan fueron significativamente diferentes entre estos agonistas. Habiendo seleccionado 4A7C-301 entre los derivados de CQ, elegimos los residuos S441, I573, A586, I588, K590, L593, D594, T595, L596 y F598 que se identificaron previamente como sitios de interacción con CQ37. Se observó una reducción significativa de la actividad transcripcional en las construcciones con mutaciones como máximo (I573, I588, L593, D594, T595, L596 y F598) pero no en todos estos residuos en patrones similares con CQ y 4A7C-301 (Fig. 1g). . Esos hallazgos confirman que estos sitios son críticos para la activación y la interacción entre Nurr1 y CQ/4A7C-301, y revelan además que tanto CQ como 4A7C-301 activan Nurr1 mediante la unión directa a Nurr1-LBD. Las mutaciones en ciertos residuos (p. ej., S441, K590, L593 y D594) no afectaron la actividad transcripcional basal, pero disminuyeron la actividad transcripcional de Nurr1 inducida por CQ o 4A7C-301 en comparación con la construcción indicadora de tipo salvaje. Cuando estas construcciones mutantes se probaron adicionalmente tratando las células transfectadas con 4A7C-301 así como con PGA1 y AQ, la activación transcripcional de Nurr1 por 4A7C-301, pero no por AQ o PGA1, disminuyó significativamente, apoyando la conclusión de que estos residuos son específicos de 4A7C-301 (y CQ) (Figura complementaria 2). En conjunto, estos análisis de mutagénesis dirigida al sitio sugieren que diferentes agonistas sintéticos y nativos de Nurr1 interactúan con residuos compartidos y distintos dentro de Nurr1-LBD y activan específicamente la función transcripcional de Nurr1. Además, el ensayo de competencia/unión de radioligando utilizando [3H]-CQ demostró que CQ y 4A7C-301 pueden competir con [3H]-CQ por la unión a Nurr1-LBD con IC50 de 1,03 ± 0,61 µM y 48,22 ± 22,05 nM, respectivamente ( Figura 1h). Además, un ensayo de unión de ligando que utiliza un sistema de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) junto con hidroxi-CQ (HCQFluo), CQ y 4A7C-301 marcados con fluorescencia compitió con HCQFluo con IC50 de 2,33 ± 0,52 µM y 107,71. ± 14,14 nM, respectivamente (Fig. 1i). Estos resultados indican que 4A7C-301 tiene una afinidad de unión 20 veces mayor por Nurr1-LBD que por CQ, lo que coincide con su mayor potencia. Cuando se probó en otra línea celular dopaminérgica murina, MN9D38, 4A7C-301 nuevamente exhibió una potencia mucho mayor (~ 50 veces) que CQ para activar Nurr1 (Figuras complementarias 3a, b).

Para determinar si CQ y 4A7C-301 pueden inducir efectos neuroprotectores, tratamos células N27-A y MN9D que fueron expuestas al inhibidor del complejo mitocondrial I, 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+) con CQ o 4A7C-301. CQ y 4A7C-301 disminuyeron significativamente la citotoxicidad inducida por MPP+ de una manera dependiente de la dosis, y 4A7C-301 mostró su máxima eficiencia a una concentración ~20 veces menor que CQ tanto en N27-A (Figura complementaria 1f, g) como en MN9D. células (Fig. complementaria 3c, d). Para confirmar que estos efectos neuroprotectores de CQ/4A7C-301 dependen de Nurr1, probamos la viabilidad celular y la citotoxicidad contra MPP+ en condiciones de sobreexpresión (OE) o derribadas (KD) de Nurr1 en células N27-A y MN9D. Nurr1 OE potenció los efectos neuroprotectores de CQ (100 µM) y 4A7C-301 (1 µM) contra MPP+ en comparación con el control (Fig. 2a, b; Fig. complementaria 3e, f). Por el contrario, Nurr1 KD no solo redujo significativamente la viabilidad celular en ausencia de MPP+ (aproximadamente 20%), sino que también anuló por completo los efectos neuroprotectores de CQ y 4A7C-301 contra MPP+ tanto en N27-A (Fig. 2a, b) como en Células MN9D (Figura complementaria 3e, f), lo que sugiere fuertemente que la neuroprotección por CQ y 4A7C-301 se produce mediante la activación de Nurr1. A continuación, investigamos si la disfunción mitocondrial y/o el estrés oxidativo están implicados en la viabilidad celular. El tratamiento de células N27-A con MPP+ indujo fuertemente los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), como se detectó mediante tinción con el indicador fluorescente de ROS, diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFDA), que se redujo significativamente con CQ (100 µM). ) y 4A7C-301 (1 µM) (Figura complementaria 1i). Estos efectos fueron potenciados por Nurr1 OE pero disminuidos por Nurr1 KD (Figura complementaria 1i). Además, el tratamiento con MPP+ desencadenó una disfunción mitocondrial importante que condujo a una capacidad reducida de OXPHOS (Fig. 1j-o complementaria), que fue restaurada eficientemente por CQ (100 µM) y 4A7C-301 (1 µM), como lo demuestran los aumentos en la respiración basal. , respiración máxima, recambio de ATP, así como cambios en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) después de la inyección de FCCP, cuyos efectos fueron mejorados aún más por Nurr1 OE, pero anulados casi por completo por Nurr1 KD (Figura complementaria 1j-o).

a, b Viabilidad celular analizada mediante reducción de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) (a) y citotoxicidad medida mediante liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) (b) con Nurr1 OE y KD en células N27-A. ***P < 0,001, ****P < 0,0001 en comparación con el tratamiento con vehículo (VEH) en condiciones de control; ###P < 0,001, ####P < 0,0001 comparado entre cada grupo de tratamiento, ANOVA de dos vías, prueba post-hoc de Tukey; n = 4 muestras biológicamente independientes por grupo. Los datos son media ± sem c Imágenes de inmunofluorescencia representativas de TH (rojo) e Iba-1 (verde) de cocultivo de neurona-glia de VM tratada con MPP+- o LPS en ausencia o presencia de CQ o 4A7C-301. Barra de escala, 100 µm. d – g Cuantificación de neuronas TH+ (d, e) y microglia Iba-1+ (f, g) contadas y transformadas como porcentaje del control del vehículo (VEH), de CQ (d, f) o 4A7C-301 (e, g ) condición tratada. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 en comparación con 0 nM, prueba t múltiple no apareada de dos colas; n = 3 muestras biológicamente independientes por grupo. Los datos son media ± sem de dos experimentos biológicamente independientes.

Los datos anteriores mostraron que la activación de Nurr1 por sus agonistas puede producir efectos neuroprotectores. Para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes, a continuación buscamos abordar si los factores de riesgo asociados con la EP (ambientales y/o genéticos) pueden alterar la expresión de Nurr1 y otros factores de transcripción clave de mDAN. Primero examinamos los niveles de proteína en células MN9D después de la exposición a MPP+ (0,5 mM). Sorprendentemente, los niveles de proteína Nurr1 se redujeron significativamente, a partir de las 8 h, y disminuyeron más del 70% después de 24 h de exposición (Figuras complementarias 4a, b). En marcado contraste, la exposición a MPP+ no afectó la expresión de otros factores clave (es decir, Pitx3, FoxA2 y Lmx1A) ni la proteína β-actina. Además, la sobreexpresión de α-sinucleína de tipo salvaje (αSynWT) o mutante (αSynA53T) también reguló significativamente a la baja la proteína Nurr1, pero no otros factores (Figuras complementarias 4c-e). La forma mutante (αSynA53T) exhibió mayores efectos que la de tipo salvaje. Estos datos están en línea con estudios previos que informan que la expresión de Nurr1 se reduce significativamente en pacientes con EP18,19,20,39, así como en modelos animales de EP que sobreexpresan αSyn40,41. También encontramos que los tratamientos con CQ y 4A7C-301 restauraron significativamente los niveles de proteína Nurr1 contra la sobreexpresión de MPP+ y αSynWT, pero los niveles de Nurr1 se mantuvieron contra la sobreexpresión de αSynA53T solo con 4A7C-301 (Figura complementaria 4g, i). A continuación, investigamos si CQ y 4A7C-301 regulan/aumentan la expresión del gen Nurr1. El tratamiento con MPP+ o la sobreexpresión de αSyn mutante y de tipo salvaje redujo sustancialmente la expresión del ARNm de Nurr1 en células MN9D. Sin embargo, el tratamiento con CQ o 4A7C-301 no alteró los niveles de ARNm de Nurr1 (Figura complementaria 4f, h), aunque los niveles de proteína se restauraron significativamente (Figura complementaria 4g, i). En conjunto, estos datos sugieren que CQ y 4A7C-301 regulan los niveles de la proteína Nurr1 en el nivel postranscripcional sin cambiar los niveles de ARNm, probablemente mejorando la estabilidad de la proteína Nurr1, que es vulnerable y está regulada negativamente por la toxicidad de MPP+ o αSyn. Además, determinamos los efectos de CQ y 4A7C-301 sobre la expresión de genes dopaminérgicos, incluidos TH, transportador de dopamina (DAT), L-aminoácido descarboxilasa aromática (AADC), transportador vesicular de monoamina 2 (VMAT2) y c-Ret en dos experimentos dopaminérgicos in vitro. sistemas, línea celular MN9D y células primarias mesencefálicas ventrales (VM) de ratón. CQ/4A7C-301 rescató significativamente la expresión de todos estos genes probados que disminuyeron con el tratamiento con MPP+ o 6-OHDA, y 4A7C-301 exhibió efectos similares en concentraciones 20 a 40 veces más bajas que CQ (Figura complementaria 5). Cuando Nurr1 fue derribado, no solo la expresión basal de estos genes cayó más del 50%, sino que los efectos protectores de CQ y 4A7C-301 desaparecieron por completo (Figura complementaria 5h, i).

Para investigar más a fondo los efectos neuroprotectores de CQ y 4A7C-301 en un contexto más fisiológico, utilizamos un sistema de cocultivo primario de neurona-glia de VM de rata, que nos permitió examinar la supervivencia de mDAN, así como la neuroinflamación mediante activación microglial. Como se muestra en la Fig. 2c-g, el tratamiento con MPP+ (0,5 µM) o LPS (15 ng/ml) indujo de manera destacada la muerte celular de mDAN (>60%) junto con la activación de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizada 1 (Iba-1). microglía positiva. El tratamiento previo con CQ o 4A7C-301 rescató significativamente los mDAN de manera dosis dependiente. 4A7C-301 mostró un efecto máximo a 500 nM, que es una concentración 40 veces menor que la requerida para un efecto CQ similar (20 µM) (Fig. 2d, e). Además, 4A7C-301 suprimió de manera óptima la activación microglial contra LPS a 500 nM, que es 40 veces menor que CQ (Fig. 2f, g). Para determinar si CQ y 4A7C-301 pueden suprimir la expresión de genes proinflamatorios en la microglía (en ausencia de mDAN), utilizamos LPS para inducir inflamación en células BV2 derivadas de la microglía de ratón, lo que llevó a una inducción espectacular del tumor. gen del factor de necrosis α (TNFα), que fue fuertemente suprimido por CQ y 4A7C-301 (Figura complementaria 6). En este ensayo, 4A7C-301 exhibió una potencia mucho mayor que CQ, con EC50 de ~1 y ~100 nM, respectivamente. En conjunto, nuestros datos muestran que 4A7C-301 protege los mDAN de la muerte celular inducida por MPP+ y LPS al tiempo que suprime la neuroinflamación con una potencia mucho mayor que la CQ para ambos efectos.

Se sabe que CQ (y AQ) inhiben la autofagia al alterar la fusión madura de autofagosoma-lisosoma para formar autofagolisosomas (APL) en la última etapa del proceso de autofagia42,43,44. Dado que la autofagia desregulada está implicada en la patología de la EP7, determinamos si 4A7C-301 también afecta la autofagia. Primero estudiamos las células HeLa, que se utilizan ampliamente para estudiar la regulación de la autofagia. Con este fin, empleamos el ensayo fluorescente en tándem mRFP-GFP-LC3 en el que GFP, pero no mRFP, se degrada en lisosomas ácidos45. En condiciones de inanición con medio EBSS, la inducción de autofagia se evidenció por un mayor número de puntos amarillos (mRFP+/GFP+) y rojos (mRFP+/GFP-), que representan la formación de autofagosoma y APL, respectivamente. Como se esperaba, la incubación con un potente inhibidor de la bomba de protones lisosomal, bafilomicina A1 (BafA1), inhibió completamente el paso final de la autofagia, como lo muestran los aumentos de puntos amarillos, pero no de puntos rojos, en comparación con la condición de control EBSS (Figura complementaria 7a). , b). El tratamiento con CQ inhibió significativamente la formación de APL, como lo indica un porcentaje reducido de puntos rojos entre el total de puntos LC3 (21,7%), en comparación con el de la condición EBSS (62,0%). En marcado contraste, el tratamiento con 4A7C-301 no inhibió la formación de APL, como lo muestra el 63,9 % de puntos rojos entre el total de puntos LC3. Cuando realizamos este ensayo en células N27-A, observamos un patrón idéntico al de las células HeLa, lo que muestra que CQ, pero no 4A7C-301, inhibe el proceso de autofagia (Fig. 3a, b). Dado que se sabe que la CQ afecta la acidez lisosomal46, examinamos su efecto sobre el pH lisosomal. BafA1 y CQ, pero no 4A7C-301, aumentaron significativamente el pH lisosomal tanto en las células HeLa (Fig. 7c, d) como en las células N27-A (Fig. 3c, d), proporcionando posibles mecanismos subyacentes a sus efectos diferenciales en la autofagia. Además, analizamos el flujo autofágico mediante transferencia Western de marcadores de autofagia específicos de etapa en células HeLa. Los cambios de expresión de LC3B-II y p62 mostraron que la autofagia se inició pero no terminó en presencia de BafA1 y CQ (Figuras complementarias 7e-g). Por el contrario, la autofagia se completó en presencia de 4A7C-301, como lo demuestra la disminución del nivel de p62 (Figura complementaria 7g). También analizamos el flujo autofágico en células N27-A con o sin administración de MPP+ (1 mM). Al igual que en las células HeLa, la autofagia se produjo en presencia de 4A7C-301, pero no de BafA1 o CQ (Fig. 3e-g). Cuando se administró MPP+, la autofagia se interrumpió, como lo demuestra la acumulación de LC3B-II y los niveles consistentes de p62 en etapa tardía. Curiosamente, el tratamiento con 4A7C-301 restauró significativamente la autofagia en presencia de MPP+ en células N27-A, lo que llevó a una degradación exitosa de p62 (Fig. 3g). Finalmente, aunque 4A7C-301 exhibió su efecto máximo a ≤1 µM en todos los ensayos, no inhibió la autofagia incluso cuando se usaron concentraciones 10 veces más altas (Figuras complementarias 7h-j).

a, b Ensayo de formación de autofagolisosoma (APL) en células N27-A. a Imágenes de fluorescencia en tándem mRFP-GFP-LC3 para la detección de APL. Barras de escala, 20 µm. b El número de puntos LC3 amarillos y puntos LC3 rojos por célula se contó a partir de 10 células aleatorias en cada pocillo por triplicado para cada condición (un total de 30 células por cada grupo). Prueba t no apareada de dos colas. Los datos son media ± sem c, d Detección de pH lisosomal en células N27-A. c Imágenes de fluorescencia LysoSensor™ Amarillo/Azul DND-160. Barras de escala, 20 µm. d Cuantificación de 5 células aleatorias en cada pocillo por triplicado para cada grupo de tratamiento (un total de 15 células por cada grupo). Prueba t no apareada de dos colas. Los datos son medias ± sem e –g de análisis de transferencia Western para flujo autofágico en células N27-A. Marcadores de flujo autofágico Expresiones LC3B y p62 (e) y cuantificación de sus niveles de expresión (f, g). *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001, ####P < 0,0001 en comparación con EBSS, ANOVA de dos factores, comparaciones múltiples de Bonferroni; n = 3 muestras biológicamente independientes por grupo. Los datos son media ± sem

Los hallazgos anteriores nos llevaron a plantear la hipótesis de que 4A7C-301 puede exhibir potentes efectos modificadores de la enfermedad en modelos animales de EP. Para abordar esto, utilizamos dos modelos de ratón, uno basado en una neurotoxina (MPTP) y el otro en un factor genético (αSyn). Primero, utilizamos un modelo de ratón macho subcrónico inducido por MPTP (30 mg/kg/día, 5 días) administrando CQ (40 mg/kg/día), 4A7C-301 (5 mg/kg/día) o L-DOPA (50 mg/kg/día) durante 16 días (Fig. 4a). Los ratones tratados con MPTP manifestaron deterioro de la función motora en comparación con el grupo de control de vehículo (VEH) en las tres pruebas (pruebas de rotarod, polo y cilindro), que fue rescatado significativamente por los tres fármacos con eficacia similar, aunque se utilizó 4A7C-301 aproximadamente una décima parte de las concentraciones de CQ y L-DOPA (Fig. 4b-d). Dado que la disfunción olfativa es un pródromo frecuente de la EP47, investigamos si estos compuestos podrían mejorar esta disfunción no motora. En la prueba de discriminación olfativa, los ratones lesionados por MPTP permanecieron menos tiempo en la ropa de cama vieja, lo que indica una dificultad para distinguir entre olores familiares y no familiares. CQ y 4A7C-301, pero no L-DOPA, restauraron significativamente el olfato (Fig. 4e). A continuación, examinamos las puntuaciones de movimientos involuntarios anormales (AIM), incluida la discinesia axial, de las extremidades y orolingual, cada dos o tres días, para controlar el comportamiento similar a la discinesia. De acuerdo con la literatura48, el tratamiento con L-DOPA desencadenó MIA graves a partir de los 7 días posteriores a la inyección (Fig. 4f y Fig. Suplementaria 8f, g). Por el contrario, el tratamiento con CQ o 4A7C-301 no indujo ningún AIM detectable. Para probar si estas mejoras de comportamiento se debieron a la neuroprotección, analizamos estereológicamente los datos inmunohistoquímicos y observamos que las fibras TH+ en el cuerpo estriado (STR) y las neuronas TH+ DA y las neuronas NeuN+ en la sustancia negra (SN) se retuvieron significativamente después de CQ y 4A7C-301. tratamiento pero no con L-DOPA en comparación con el grupo de solo MPTP (Fig. 4g-k). También examinamos si la neuroinflamación se vio afectada, utilizando Iba-1 como marcador microglial activado. Como se muestra en la Fig. 4l-n, el tratamiento con MPTP aumentó significativamente la microglía Iba-1+ tanto en STR como en SN. El tratamiento con CQ y 4A7C-301, pero no con L-DOPA, redujo notablemente la microglía Iba-1+ en ambas regiones. Además, probamos si los niveles de DA se restauraron mediante el tratamiento con CQ y 4A7C-301. El tratamiento con 4A7C-301 restauró significativamente los niveles de DA tanto en SN como en STR, mientras que CQ lo hizo solo en SN (Figuras complementarias 10a-c). Finalmente, repetimos estas pruebas de comportamiento en una etapa crónica, en los días 14 a 15, observando patrones de comportamiento similares en las pruebas olfativas y AIM (Figuras complementarias 8b-e). Sin embargo, sólo persistieron los déficits del motor rotarod, mientras que en las pruebas de polos y cilindros los déficits desaparecieron, lo que sugiere cierto nivel de recuperación espontánea49,50,51. En conjunto, el modelo de ratón lesionado por MPTP demostró que 4A7C-301 mejora los déficits motores y no motores con una disminución de la neuroinflamación y sin efectos secundarios similares a la discinesia. Sin embargo, la lesión MPTP tiene limitaciones como modelo de EP, incluidos ciertos niveles de recuperación espontánea. Por lo tanto, a continuación utilizamos el modelo de ratón basado en AAV2-αSyn, que imita más fielmente las características progresivas y fisiopatológicas relacionadas con la patogénesis de la EP humana52.

a Representación esquemática de las administraciones de L-DOPA, CQ y 4A7C-301 a ratones macho inducidos por MPTP. b – d Pruebas de comportamiento involucradas en la coordinación motora y el movimiento espontáneo evaluados mediante rotarod (b), prueba de polo (c) y prueba de cilindro (d). ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey. Los datos son media ± sem e Prueba de comportamiento involucrada en la disfunción olfativa evaluada mediante una prueba de discriminación olfativa. Izquierda, duración de la estancia entre ropa de cama nueva y vieja. ANOVA de dos vías, comparaciones múltiples de Bonferroni. Los datos son media ± sem Derecha, velocidad durante la sesión. ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey. Los datos son media ± sem f Puntuación global de AIM calculada multiplicando las puntuaciones de AIM básica y de amplitud (Figura complementaria 8f, g). Los datos son análisis inmunohistoquímicos medios ± sem g – k de neuronas TH+ DA (g – j) y neuronas NeuN+ (I, k) en STR (g, h) y SNpc (i – k). Barras de escala, 500 µm. ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey. Los datos son media ± sem l–n Análisis inmunohistoquímicos de la microglía Iba-1+ mediante el conteo en STR (m) y SNpc (n). Barras de escala, 500 µm. ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey. Los datos son media ± sem

Inyectamos virus adenoasociado 2 (AAV2) que expresa αSyn de tipo salvaje (αSynWT) o mutante (αSynA53T) unilateralmente en el SN (hemisferio izquierdo) de ratones macho C57BL/6 J. Se administró (ip) CQ (40 mg/kg/día) o 4A7C-301 (5 mg/kg/día) desde la cuarta a la octava semana después de la cirugía (Fig. 5a). Tanto los ratones inducidos por αSynWT como αSynA53T manifestaron una pérdida prominente de mDAN (Fig. 5b) y déficits motores en las pruebas de cilindro (Fig. 5c, d), rotarod (Fig. 9a, c) y polo (Fig. 9b complementaria). d) a partir de la sexta semana después de la cirugía, con mayor gravedad en ratones inducidos por αSynA53T. El tratamiento con CQ condujo a una recuperación parcial de la crianza (Fig. 5c), latencia para caer (Fig. complementaria 9a) y tiempo para atravesar el poste (Fig. complementaria 9b). El tratamiento con 4A7C-301 mejoró los déficits motores con mayor potencia que CQ en ratones inducidos tanto por αSynWT como por αSynA53T en todas las pruebas evaluadas (Fig. 5d, Fig. Suplementaria 9c, d). En la prueba de discriminación olfativa, los ratones inducidos por αSynWT y αSynA53T mostraron disfunción olfativa a partir de la cuarta semana después de la cirugía (Fig. 5e, fy Fig. Suplementaria 9e-g). Tanto el tratamiento CQ como el 4A7C-301 rescataron la disfunción olfativa en ratones αSynWT a las 6 y 8 semanas después de la cirugía. Sin embargo, solo 4A7C-301 revirtió significativamente la disfunción olfativa en ratones αSynA53T, mientras que no hubo diferencias significativas en la velocidad/movilidad entre los grupos (Fig. 5f y Fig. Suplementaria 9g). Después de las pruebas de comportamiento, sacrificamos ratones y caracterizamos los efectos del tratamiento en sus cerebros mediante análisis inmunohistoquímicos. La cuantificación estereológica reveló que tanto los tratamientos con CQ como con 4A7C-301 previnieron parcialmente la pérdida de neuronas TH+ y NeuN+ y fibras TH+ en el SN y en el STR de ratones αSynWT, respectivamente (Fig. 5g-k). Sin embargo, sólo el tratamiento con 4A7C-301 evitó significativamente la pérdida de neuronas y fibras TH+ y NeuN+ en ratones αSynA53T. De acuerdo con estos datos, tanto CQ como 4A7C-301 aumentaron significativamente los niveles de DA en SN y STR de ratones αSynWT, mientras que solo 4A7C-301 aumentaron los niveles de DA de ratones αSynA53T (Figuras complementarias 10d-f). Evaluamos estereológicamente la inmunorreactividad contra αSyn fosforilada en el residuo de serina 129 (αSynS129), que se asocia con la facilitación de la formación de LB y la neurodegeneración acelerada en PD53. Como se muestra en la Fig. 5l, m, se detectó αSynS129 en el SN de ratones αSynWT, y más abundantemente en ratones αSynA53T. Si bien los tratamientos con CQ y 4A7C-301 disminuyeron significativamente αSynS129 en ratones αSynWT, solo 4A7C-301 lo redujo significativamente en ratones αSynA53T, lo que sugiere que 4A7C-301 alivió eficazmente los fenotipos patógenos en estos modelos animales con una mayor potencia que CQ.

a Representación esquemática de las administraciones de CQ y 4A7C-301 a ratones macho inyectados con AAV-αSyn. b Imágenes representativas de inmunofluorescencia de TH (rojo) y GFP (verde) de dos experimentos independientes en el SNpc de ratones inyectados con AAV-αSynWT o -αSynA53T. Barras de escala, 500 µm. c, d Pruebas de cilindros con grupo tratado con CQ (c) o 4A7C-301 (d). †††P < 0,001, ††††P < 0,001 en comparación entre GV y WV; *P < 0,05, ****P < 0,0001 en comparación entre GV y AV; #P < 0,05 en comparación con WV y WC o W301; §§§§P < 0,0001 en comparación con AV con AC o A301. ANOVA bidireccional, comparaciones múltiples de Tukey; n = 8 por grupo. Los datos son media ± sem GV, GFP + VEH; WV, αSynWT + VEH; AV, αSynA53T + VEH; WC, αSynWT + CQ; AC, αSynA53T + CQ; W301, αSynWT + 4A7C-301; A301, αSynA53T + 4A7C-301. e, f Prueba de discriminación olfativa realizada a las 8 semanas de la cirugía. e Duración de la estancia entre ropa de cama nueva y vieja. ANOVA de dos vías, comparaciones múltiples de Bonferroni. Los datos son media ± sem f Velocidad durante la sesión. ns, no significativo (P > 0,05), ANOVA unidireccional. Los datos son media ± sem n = 8 por grupo. g, h Análisis inmunohistoquímicos de neuronas TH+ mediante densitometría en el STR. Barra de escala, 500 µm. ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey; n = 5 por grupo. Los datos son análisis inmunohistoquímicos medios ± sem i – k de neuronas TH+ DA (I, j) y neuronas NeuN+ (I, k) en el SNpc. Barras de escala, 500 µm. ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey; j, n = 5 por grupo; k, n = 4 por grupo. Los datos son media ± sem l Inmunohistoquímica representativa de pS129 en el SNpc. Barras de escala, 250 µm. m, Cuantificación de células pS129 αSyn+ mediante recuento. ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey; n = 5 por grupo. Los datos son media ± sem n análisis de transferencia Western de αSyn humano en el SNpc de ratones inyectados con AAV-αSyn. Los valores se expresan como una expresión relativa en comparación con el lado contralateral. ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey; n = 3 por grupo. Los datos son media ± sem o–q Análisis inmunohistoquímicos de la microglía Iba-1+ mediante el conteo en STR (p) y SNpc (q). ANOVA unidireccional, prueba post-hoc de Tukey; n = 5 por grupo. Los datos son media ± sem Barras de escala, 250 µm.

A pesar de numerosos estudios que investigan la fisiopatología de la EP, aún no se dispone de mecanismos claros subyacentes a la pérdida de mDAN en el SN ni de tratamientos modificadores de la enfermedad adecuados. Aunque está bien establecido que Nurr1 regula críticamente el desarrollo, mantenimiento y protección de los mDAN, está relativamente indocumentado si participa en la patogénesis de la EP y cómo lo hace. Para abordar este problema, probamos si los factores de riesgo ambientales (p. ej., MPP+) y/o genéticos (p. ej., αSyn) para la EP comprometen la expresión y función de Nurr1. Nuestros datos revelaron que tanto el tratamiento con MPP+ como la sobreexpresión de αSyn regulan a la baja de forma robusta la expresión de Nurr1. Por el contrario, estos tratamientos no afectaron la expresión de otros factores de transcripción clave de mDAN (p. ej., Pitx3, FoxA2 y Lmx1A) o β-actina. La sobreexpresión de formas patógenas de αSyn resultó en una mayor reducción de los niveles de Nurr1 que el tipo salvaje. Estos datos indican que, aunque Nurr1 es fundamental para las mDAN, como guardián, su exposición continua a factores de riesgo de EP (tanto genéticos como ambientales) compromete su expresión y/o función, lo que contribuye a la degeneración de las mDAN. Dado que los niveles de Nurr1 están regulados a la baja en estudios postmortem de cerebros envejecidos20, nuestro modelo explica no solo la pérdida de mDAN dependiente de la edad, sino también la pérdida inducida por factores ambientales y genéticos. Esta conclusión está en línea con estudios previos post mortem en humanos y en modelos animales y sugiere además la posibilidad de que la expresión/función comprometida de Nurr1 pueda ser la base de la degeneración de mDAN tanto en la EP familiar como en la esporádica, lo que proporciona un posible mecanismo unificador de la patogénesis de la EP.

Para abordar nuestra hipótesis de que Nurr1 es un objetivo molecular prometedor para la intervención en la EP, previamente establecimos sistemas de detección de alto rendimiento para detectar activadores de Nurr1 e identificamos tres compuestos (es decir, CQ, AQ y glafenina) que comparten un andamio idéntico 4A7C. Con base en estos hallazgos, nosotros y otros planteamos la hipótesis de que 4A7C representa un SAR para la unión y activación de Nurr124,54. Utilizando este supuesto SAR (4A7C), generamos >570 derivados de CQ y los caracterizamos, lo que resultó en la identificación de un agonista optimizado, 4A7C-301. Aquí, probamos 4A7C-301 y CQ para determinar sus efectos en varios modelos de EP in vitro e in vivo y proponemos que 4A7C-301 puede proporcionar un tratamiento modificador de la enfermedad para la EP, como lo demuestran los siguientes resultados.

En primer lugar, 4A7C-301 mostró una afinidad de unión ~20 veces mayor en comparación con CQ o AQ y su activación de la función de Nurr1 requiere la presencia de aminoácidos específicos dentro de Nurr1-LBD. Además, 4A7C-301 potenció fuertemente la actividad transcripcional de Nurr1 y exhibió efectos neuroprotectores para los mDAN expuestos a neurotoxinas (p. ej., MPP+ y LPS) con mayor potencia que CQ (>20 veces), lo que sugiere una activación de Nurr1 basada en mecanismos. Nuestros datos revelaron que 4A7C-301 mejora eficazmente tanto la función activadora transcripcional de Nurr1 (p. ej., expresión de genes específicos de mDAN y producción de DA en mDAN) como su función represora (p. ej., supresión de genes de citocinas proinflamatorias y activación microglial) con igual mayor eficiencia que CQ (>20 veces). En segundo lugar, observamos que el tratamiento con CQ o 4A7C-301 restauró significativamente los niveles de proteína Nurr1 que se redujeron con el tratamiento con MPP+ y la sobreexpresión de αSyn sin cambios en sus niveles de ARNm, lo que sugiere fuertemente que los ligandos de Nurr1 pueden regular los niveles de la proteína Nurr1 en el nivel postranscripcional. niveles. Por lo tanto, especulamos que los ligandos de Nurr1 pueden regular la estabilidad de la proteína Nurr1, que es vulnerable y está regulada negativamente por la toxicidad ambiental (MPP+) y/o genética (αSyn) y que 4A7C-301 (y CQ en menor grado) exhibe efectos neuroprotectores al dos mecanismos distintos: (1) activar la función transcripcional de Nurr1 y (2) estabilizar y restaurar los niveles de proteína Nurr1. En tercer lugar, utilizando diversos modelos celulares, encontramos que 4A7C-301 protege sustancialmente las células mDA a través de múltiples vías posteriores, como la reducción del estrés oxidativo y la citotoxicidad, la protección de la función mitocondrial, la inducción de la expresión génica específica de mDAN, incluido el receptor de GDNF c-ret. y reducción de la neuroinflamación. Además, mientras que CQ inhibe la autofagia, 4A7C-301 no lo hace. De hecho, 4A7C-301 restaura las funciones de autofagia celular deterioradas por el tratamiento con MPP+. Dado que CQ es un prototipo de inhibidor de la autofagia y se sabe que acelera la deposición de la patología αSyn55, la inhibición de la autofagia de CQ y la protección de la autofagia de 4A7C-301 es una distinción importante. Especulamos que la misma estructura central permite que CQ y 4A7C-301 se unan a Nurr1 (relacionado con el supuesto SAR) y muestren actividades similares en la mayoría de los ensayos, mientras que sus diferentes estructuras de cadenas laterales probablemente subyacen a sus distintos efectos sobre la autofagia. En apoyo de esto, CQ y BafA1, ambos conocidos inhibidores de la autofagia, aumentaron significativamente el pH lisosomal, mientras que 4A7C-301 no tuvo ningún efecto, lo que sugiere posibles mecanismos subyacentes a los diferentes efectos de CQ/4A7C-301 sobre la autofagia. En cuarto lugar, en modelos de ratón inducidos por MPTP y αSyn, 4A7C-301 restableció significativamente los déficits motores y el comportamiento no motor (p. ej., defectos olfativos) sin ningún efecto secundario similar a la discinesia. Una limitación importante de los tratamientos farmacológicos actuales de la EP es que eventualmente inducen efectos secundarios como discinesia en muchos pacientes8,9. Como se esperaba, la administración de L-DOPA indujo un comportamiento robusto similar a la discinesia en ratones inducidos por MPTP. En marcado contraste, a pesar de mejoras comparables en las pruebas motoras, el tratamiento con 4A7C-301 o CQ no indujo ningún comportamiento detectable similar a la discinesia. Un posible mecanismo de acción de 4A7C-301/CQ en el modelo MPTP es que pueden influir en el metabolismo de MPTP a MPP+. Sin embargo, esta explicación es poco probable porque 4A7C-301/CQ se administraron 6 h después de la inyección de MPTP, el momento en el que MPTP se metaboliza completamente en MPP+ tanto en el cuerpo estriado como en SN56.

Otro hallazgo interesante de este estudio es el déficit olfativo observado en los modelos de sobreexpresión inducidos por MPTP y αSyn, y que 4A7C-301 (y CQ en menor grado) rescataron significativamente este déficit, lo que sugiere la posibilidad de que los agonistas de Nurr1 puedan mejorar al menos algo. de los déficits no motores de la EP también. Estudios recientes que utilizaron modelos animales con sobreexpresión de αSyn57 o inyección de fibrillas preformadas de αSyn58 también observaron disfunción olfativa. Sin embargo, en la actualidad, los mecanismos moleculares que subyacen a la disfunción olfativa en estos modelos animales y su mejora mediante los agonistas de Nurr1 siguen siendo difíciles de alcanzar y esperan más investigaciones. Finalmente, nuestros datos revelaron que Nurr1 y αSyn se regulan recíprocamente entre sí tanto in vitro como in vivo, lo que está influenciado de manera destacada por 4A7C-301. Si bien la sobreexpresión de αSyn regula negativamente Nurr1, por el contrario, la acumulación de αSyn disminuyó significativamente con 4A7C-301 incluso cuando su forma patógena (αSynS129) estaba sobreexpresada.

A pesar de estos datos prometedores, cabe señalar que el 4A7C-301 tiene limitaciones. Por ejemplo, el modo de acción a través del cual 4A7C-301 regula la función transcripcional y/o expresión de Nurr1 no está claro. Esta cuestión es fundamental porque Nurr1 puede funcionar como activador transcripcional y represor en diferentes contextos celulares y 4A7C-301 influye en ambas funciones. Además, es necesario abordar plenamente los posibles efectos no deseados y las toxicidades del 4A7C-301 al evaluar su potencial terapéutico. En resumen, si bien se justifican más estudios, llegamos a la conclusión de que Nurr1 representa un objetivo prometedor para el desarrollo de agentes terapéuticos neuroprotectores. Los agonistas dirigidos optimizados, como 4A7C-301 o sus compuestos análogos, pueden tener el potencial como tratamientos modificadores de la enfermedad basados ​​en mecanismos para la EP tanto esporádica como familiar.

Todos los procedimientos experimentales siguieron las pautas del Instituto Nacional de Salud y todos los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital McLean (Protocolo #: 2015N000002).

Todos los productos químicos utilizados en la síntesis se adquirieron de Sigma-Aldrich y se utilizaron sin modificaciones adicionales. Se usó cromatografía en capa fina para controlar el progreso de las reacciones usando placas de TLC pre-revestidas (E. Merck Kieselgel 60 F254) visualizándose los puntos mediante vapores de yodo/lámpara UV. Los compuestos se purificaron sobre una columna de gel de sílice (malla 60-120) o se recristalizaron con disolventes adecuados. Los disolventes se destilaron antes de su uso con fines de purificación. Los puntos de fusión se registraron en un aparato automatizado de punto de fusión ERS y no están corregidos. Los espectros IR se registraron utilizando un Perkin-Elmer y un Bruker FT-IR y los valores se expresan como λmax cm-1. Los datos espectrales de masas se registraron en un sistema Jeol-AccuTOF JMS-T100LC y espectrómetro de masas/datos LCT de micromasa. Los espectros de RMN 1H y RMN 13C se registraron en un espectrómetro Jeol Spectrospin a 400 MHz y 100 MHz, respectivamente, utilizando TMS como estándar interno. Los valores de desplazamiento químico se registran en la escala δ y las constantes de acoplamiento (J) están en Hz.

Se agitó una mezcla de 4,7-dicloroquinolina (1, 10,0 g, 50,49 mmol) y etano-1,2-diamina (2a, 16,9 ml, 252,45 mmol) a 120 °C durante 6 h (Esquema 1). Luego se enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se le añadió agua helada. El sólido así obtenido se filtró y se lavó con exceso de agua. El producto bruto se cristalizó usando etanol y se usó como tal para la siguiente etapa.

Se tomaron el intermedio 3 (5 g, 22,6 mmol) y el compuesto 4 (4,14 g, 22,6 mmol) en un matraz de fondo redondo que contenía 50 ml de THF. Se añadió gota a gota trietilamina (9,5 ml, 67,8 mmol) a la mezcla de reacción anterior. Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se agitó durante la noche a 60 °C. Después de completarse la reacción, como se observó por TLC, la mezcla de reacción se vertió en hielo triturado para precipitar la mezcla de los compuestos 5A y 5B en bruto. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna usando MeOH-CHCl3 al 5% como eluyente para producir 5 A (rendimiento del 25%, menor) y 5B (rendimiento del 53%, mayor) como los dos regioisómeros de pirimidina 5 A y 5B.

Sólido blanco. Rendimiento: 25%; pf: 237-239ºC; IR (KBr, cm-1): 3262, 3113, 1549, 1445, 1234, 1128, 1097, 806; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 3,45-3,53 (m, 4H), 6,71 (d, J = 5,50 Hz, 1H), 6,90 (s, 1H), 7,39-7,46 (m, 2H ), 7,79 (d, J = 2,20 Hz, 1H), 8,19 (d, J = 9,07 Hz, 1H), 8,27 (d, J = 5,77 Hz, 1H), 8,41 (d, J = 5,36 Hz, 1H); anal. calculado para C15H12Cl3N5: C, 48,87; H, 3,28; norte, 19.00 horas; encontrado: C, 48,96; H, 3,30; norte, 18,97; ESI-HRMS (m/z) calculado para C15H13Cl3N5 (M + H)+: 368,0231, encontrado: 368,0237 (M + H)+, 370,0211 (MH + 2)+, 372,0178 (MH + 4)+.

Sólido blanco. Rendimiento: 53%; pf: 235-237ºC; IR (KBr, cm-1): 3348, 2940, 1566, 1447, 1358, 1271, 1120, 984, 804; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 3,45-3,60 (m, 4H), 6,54 (s, 1H), 6,70 (d, J = 5,36 Hz, 1H), 7,44-7,47 (m, 2H ), 7,79 (d, J = 1,92 Hz, 1H), 8,20 (d, J = 9,07 Hz, 1H), 8,37-8,43 (m, 2H); anal. calculado para C15H12Cl3N5: C, 48,87; H, 3,28; norte, 19.00 horas; encontrado: C, 49,01; H, 3,30; norte, 19,05; ESI-HRMS (m/z) calculado para C15H13Cl3N5 (M + H)+: 368,0231, encontrado: 368,0242 (M + H)+, 370,0214 (MH + 2)+, 372,0181 (MH + 4)+.

Se añadieron el compuesto 5 A (200 mg, 0,54 mmol) y N-etilpiperazina (1,4 ml, 10,85 mmol) a un tubo sellado y la mezcla de reacción se calentó durante 5 horas a 110 °C. Una vez completada la reacción, la mezcla se vertió en agua helada. El precipitado resultante se filtró, se lavó con exceso de agua fría para eliminar la amina y se secó para obtener el producto bruto. Luego se recristalizó en etanol para obtener el producto puro en forma de un sólido blanquecino. Rendimiento: 70%; pf: 88-90ºC; IR (KBr, cm-1): 3282, 2924, 2852, 1569, 1446, 1372, 1260, 1006, 798; RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 1,09 (t, J = 7,33 Hz, 6H), 2,40-2,51 (m, 12H), 3,38-3,39 (m, 2H), 3,60 (sa, 8H), 3,83-3,88 (m, 2H), 5,05 (t, J = 6,18 Hz, 1H), 5,22 (s, 1H), 6,26 (d, J = 5,50 Hz, 1H), 7,21 (dd, J = 8,93, 2,29 Hz , 1H), 7,31 (sbr, 1H), 7,53 (d, J = 8,70 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 1,83 Hz, 1H), 8,46 (d, J = 5,50 Hz, 1H); RMN 13C (100 MHz, CDCl3): δ (ppm) 11,98, 39,62, 44,53, 47,43, 52,46, 52,59, 74,10, 98,12, 117,36, 122,61, 125,26, 128,27, 134,58, 14 9,04, 150,66, 152,05, 162,86, 164,70; anal. calculado para C27H38ClN9: C, 61,87; H, 7,31; norte, 24,05; encontrado: C, 62,01; H, 7,34; N, 23,99; ESI-HRMS (m/z) calculado para C27H39ClN9 (M + H)+: 524,3017, encontrado: 524,3019 (M + H)+, 526,2991 (MH + 2)+; Pureza por HPLC: 97,75.

Se cultivaron líneas celulares de neuroblastoma humano SK-N-BE(2)C, microglía de ratón BV2 (ATCC), HeLa y MN9D en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina 100 U/ml. y 100 µg/ml de estreptomicina. La línea celular dopaminérgica murina MN9D fue proporcionada amablemente por los Dres. Michael Zigmond y Juliann Jaumotte de la Universidad de Pittsburgh. La línea celular dopaminérgica de rata N27-A fue proporcionada amablemente por el Dr. Curt Freed de la Facultad de Medicina de la Universidad de Colorado. Las células N27-A se cultivaron en medio RPMI 1640 (Lonza) suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina36. Para el ensayo de transactividad, se transfectaron líneas celulares SK-N-BE(2)C y N27-A con pCMV-fNurr1, pGAL-Nurr1(LBD), pGAL-Nor1(LBD) o pGAL-Nur77(LBD) y constructo indicador ( p4xNL3-Luc para fNurr1 o p8xUAS-Luc para construcciones LBD). Se cotransfectó pRSV-β-gal como control interno23. Las células se lisaron en un tampón de lisis (Tris-fosfato 25 mM (pH 7,8), DTT 2 mM, DCTA 2 mM (ácido 1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-tetraacético), glicerol al 10%, y Triton X-100 al 1 %) 24 h después de la transfección, seguido de la adición de sustrato de luciferasa de luciérnaga para la detección de luminiscencia medida por un lector de placas de luminómetro (SpectraMax®; dispositivo molecular). La transactividad de Nurr1 se normalizó a la actividad de β-galactosidasa. Para los ensayos de MTT y LDH, las células N27-A se trataron durante la noche con 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+, 1 mM) en ausencia o presencia de CQ o 4A7C-301. Para la determinación de la estabilidad de Nurr1, las células MN9D se incubaron con MPP+ (0,5 mM) durante 2, 4, 8, 16, 24 y 32 h, o se transdujeron con lentivirus que expresaban GFP únicamente o αSyn (tipo salvaje o A53T) y luego se cosecharon 24 , 48 y 72 h después de la transducción. Para el ensayo de formación de autofagolisosoma (APL), se transfectaron células HeLa y N27-A con mRFP-GFP-LC3 (Addgene) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El medio se cambió con medio de inanición (solución salina equilibrada de Earle; EBSS) 24 h después de la transfección para la inducción de autofagia.

Se prepararon muestras de proteínas a partir de cosechas de células o tejidos cerebrales en tampón de homogeneización (Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, Triton X-100 al 1% (Sigma-Aldrich) que contiene PMSF 1 mM, inhibidor de proteasa. cóctel (Roche) y cóctel inhibidor de fosfatasa (Sigma-Aldrich). Se cargaron cantidades iguales de proteína total determinada por el método Bradford en un gel BoltTM 4-12% Bis-Tris Plus (Invitrogen), seguido de transferencia a membranas de PVDF (Bio -Rad) Después del bloqueo en tampón TBS-T (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM, Tween-20 al 1%) que contenía leche desnatada al 5%, las membranas se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: Nurr1 (1 :1,000; preparado en nuestro laboratorio59), LC3B (1:1,000; Cell Signaling, #2775), SQSTM1/p62 (1:1,000; Abcam, ab155686), αSyn (1:1,000; GeneTex, GTX112799), Pitx3 (1: 1.000; Invitrogen, 38-2850), FoxA2 (1:1.000; Abnova, H00003170-M12), Lmx1A (1:1.000; Millipore, AB10533) y β-actina (1:5.000; Abcam, ab8227). Los experimentos fueron confirmados por mediciones duplicadas de la misma muestra. La cuantificación de las bandas inmunorreactivas se realizó utilizando el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.) y se expresó como una proporción relativa frente a la β-actina.

El ARN total se extrajo utilizando el kit de purificación de ARN GeneJET (Thermo Fisher Scientific) y se sometieron 100 ng de ARN a la síntesis de ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc Invitrogen Superscript (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. qRT-PCR se realizó utilizando un sistema CFX Connect en tiempo real (Bio-Rad) en una mezcla de 20 μl de volumen que contenía 2X SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 100 ng/μl de cebadores directos e inversos, y 1 μl. de muestra de ADNc. Los niveles de expresión génica se cuantificaron mediante el método 2∆∆CT (Ct del gen objetivo - Ct de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH). Se utilizaron los siguientes cebadores para qRT-PCR: TH directo: 5′-CAAGGTTCCCTGGTTCCCAA-3' , reverso: 5′-CTTCAGCGTGGCGTATACCT-3′; DAT adelante: 5′-GTCACCAACGGTGGCATCTA-3′, reverso: 5′-TAGGCTCCATAGTGTGGGGG-3′; AADC adelante: 5′-CACGGCTAGCTCATACCCAG-3′, reverso: 5′-GCTCTTCCAGCCAAAAAGGC- 3′; VMAT2 adelante: 5′-ATGTGTTCCCGAAAGTGGCA-3′, atrás: 5′-AAGTTGGGAGCGATGAGTCC-3′; c-Ret adelante: 5′-TGCTGCTCTGGGAGATTGTG-3′, atrás: 5′-AACACTGGCCTCTTGTCTGG-3′; TNFα adelante: 5′-ATAGCTCCCAGAAAAGCAAGC-3′; inverso: 5′-CACCCCGAAGTTCAGTAGACA-3′; GAPDH, adelante 5′-GAAGGTCGGTGTGAACGGAT-3′, inverso 5′-TTCCCATTCTCGGCCTTGAC-3′.

Los mutantes Nurr1 se generaron utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange ǁ XL (Agilent Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de mutagénesis se llevaron a cabo en el plásmido de ratón Nurr1 clonado en la estructura principal de pcDNA3.1 y luego se verificaron mediante secuenciación.

Los ensayos de saturación y competencia se realizaron como se describió anteriormente33. Para el ensayo de saturación, se incubaron 0,2 µM de Nurr1-LBD y 125-10.000 nM de [3H]-CQ en tampón de unión (tampón de acetato de sodio 20 mM (pH 5,2)) a 4 °C durante la noche. Para el ensayo de competencia, se incubó una concentración fija de [3H]-CQ (1000 nM) con concentraciones en serie de competidores no marcados (CQ, 4A7C-301 o ácido retinoico (RA)) (10-4-105 nM) en tampón de unión a 4°C durante la noche. Se aplicaron mezclas de ensayo a filtros GF/B (Brandel Inc.) para capturar ligandos unidos a Nurr1-LBD. Los datos indican el promedio de triplicados y los valores del ensayo de competencia se transformaron como un porcentaje de inhibición con respecto a 0 nM de competidores. Todos los gráficos y valores de IC50 se generaron utilizando el programa de regresión no lineal en GraphPad Prism versión 8.0.2.

El ensayo TR-FRET se realizó en tampón de detección PPI Terbium (Tb) (PerkinElmer) y contenía 0,2 µM de Nurr1-LBD, 0,5 µM de hidroxi-CQ marcado con fluorescencia (HCQFluo; Proimaging) y concentraciones seriadas de CQ, 4A7C-301 o AR (10-4-106 nM). El anticuerpo anti-Nurr1 de conejo (3 nM; preparado en nuestro laboratorio) y la IgG-Tb anti-conejo (1:400; Cisbio, 61PARTAF) se incluyeron en la solución de ensayo como complejo donante. Las soluciones de ensayo se cargaron en un OptiPlate™ de 384 pocillos (PerkinElmer). Después de 2 h de incubación en la oscuridad a temperatura ambiente, la señal FRET se midió mediante excitación a 340 nm y emisión a 520 nm para fluoresceína y 495 nm para Tb utilizando un lector de placas VICTOR Nivo (PerkinElmer). Los datos se ajustaron utilizando el programa de regresión no lineal en GraphPad Prism versión 8.0.2.

Las células se transfectaron con Nurr1 subclonado en el vector pcDNA3.123 para la sobreexpresión de Nurr1 (OE). Para la eliminación de Nurr1 (KD), se seleccionó y transfectó shRNA de Nurr1 específico (V3LHS_411033, TCTTTCTGAACAACAAACTG; GE Dharmacon). Se utilizaron pcDNA y shRNA codificados (# RHS4346) como control negativo para Nurr1 OE o KD, respectivamente. Nurr1 OE o KD mediante transfección se analizó mediante transferencia Western.

Los virus Lenti-GFP, -αSynWT y -αSynA53T se generaron por separado cotransfectando cada plásmido lanzadera con plásmidos empaquetadores de lentivirus en células HEK293T utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen). Brevemente, se mezclaron y transfectaron 2 μg de cada plásmido lanzadera inducible FUW, 2 μg de FUW-rtTA, 2 μg de psPax2 y 1,5 μg de MD2.G en células HEK293T. Después de 48 h, los sobrenadantes virales se recogieron y se centrifugaron a 1000 g durante 10 min y posteriormente se filtraron a través de un filtro de 0,45 μm. Los lentivirus se transdujeron en células MN9D con 8 µg/ml de polibreno y el sobrenadante viral se eliminó y se reemplazó con medio nuevo un día después de la transducción.

El estrés oxidativo celular se detectó utilizando el kit de ensayo DCFDA Cellular ROS (Abcam) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células sembradas en una placa de 96 pocillos de fondo negro transparente se tiñeron con solución de DCFDA (20 µM) durante 45 minutos a 37 °C. La fluorescencia se midió a Ex/Em = 485/535 nm usando un lector de microplacas (Synergy HT; Bio-Tek) y los niveles de ROS se calcularon en relación con el control del vehículo. La citotoxicidad se determinó midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio de cultivo utilizando un kit de detección de citotoxicidad de LDH (Roche)33. La absorbancia se midió a 490 nm con un lector de microplacas y la citotoxicidad se calculó como porcentaje (%) con respecto al control TritonX-100 al 1 %. La viabilidad celular se determinó utilizando bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) como se describió anteriormente60. Brevemente, las células se incubaron con 5 mg/ml de solución de MTT (Sigma-Aldrich) durante 3,5 h a 37 °C. Los cristales de MTT formazán se disolvieron en 10 veces el volumen de disolvente MTT (HCl 4 mM y Nonidet P-40 al 0,1% en isopropanol) y la absorbancia del formazán azul generado se midió a 570 nm después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente. La viabilidad celular se calculó como porcentaje (%) de reducción de MTT en relación con el control del vehículo.

La actividad mitocondrial se midió utilizando el analizador Seahorse XFp (Agilent Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en pocillos de una miniplaca de cultivo celular XFp y se incubaron en una incubadora a 37 °C durante la noche. El ensayo se realizó después de que las células se equilibraran durante 1 h en medio de ensayo XF suplementado con D-glucosa 10 mM, piruvato de sodio 5 mM y glutamax 2 mM en una incubadora sin CO2. La actividad mitocondrial se controló mediante inyecciones secuenciales de oligomicina 1 μM, cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) 2 μM y rotenona/antimicina A 0,5 μM para calcular la respiración basal (= tasa de consumo de oxígeno basal (OCR)-rotenona/antimicina A). OCR), respiración máxima (= FCCP OCR-rotenona/antimicina A OCR), recambio de ATP (= OCR inicial-oligomicina OCR) y cambios de OCR después de la inyección de FCCP (= FCCP OCR-oligomicina OCR). Cada valor trazado se normalizó con respecto a la proteína total cuantificada mediante un ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad) y se analizó utilizando el software Seahorse WAVE Desktop (Agilent Technologies).

Las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas ventrales (VM) primarias se obtuvieron de embriones de ratones del día embrionario 13.5 (E13.5) (C57BL/6 J; Jackson Laboratory). Brevemente, los tejidos cerebrales de VM disecados se recogieron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) helada y luego se disociaron mecánicamente usando pipetas. Posteriormente, los tejidos disociados se incubaron en tripsina-EDTA al 0,05 % (Invitrogen) durante 5 minutos a 37 °C. La suspensión celular se sembró sobre cubreobjetos de vidrio en placas de 48 pocillos previamente recubiertas con 5 mg/ml de poli-L-ornitina, 5 μg/ml de fibronectina o 1 μg/ml de laminina a una densidad de 2,0 x 105 células/cm2 en diferenciación. medio (FBS inactivado por calor al 1%, L-glutamina 2 mM, suplemento de B27 50X, ácido ascórbico 100 μM y bFGF 2 μg/ml en medio neurobasal). Las neuronas VM primarias se trataron con CQ (20 μM) o 4A7C-301 (0,5 μM) con o sin 6-OHDA (20 μM) y se recolectaron para determinar la expresión del gen dopaminérgico mediante PCR en tiempo real.

El cocultivo primario de neurona-glia de VM de rata se preparó a partir de embriones de rata E14 (Fisher 344; Charles River)33. El día 7, las células se trataron previamente con CQ o 4A7C-301 30 minutos antes del tratamiento con MPP+ (0,5 μM) o lipopolisacárido (LPS, 15 ng/ml) y luego se fijaron en formaldehído al 4 % (Sigma-Aldrich) para ICC 7. días después de los tratamientos (14 días in vitro). Después de bloquear con suero de burro normal (NDS) al 10% y solución Triton X-100 al 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente, las células se incubaron con anticuerpos primarios contra TH (1:1000; Pel Freez, P40401) e Iba-1 (1 :500; Abcam, ab5076) en solución de NDS al 1% y Triton X-100 al 0,1% durante la noche a 4 °C. Se incubaron anticuerpos secundarios anti-conejo o anti-cabra conjugados con Alexa Fluor 568 o Alexa Fluor 488 (1:500; Invitrogen) después de la incubación del anticuerpo primario y luego se montaron cubreobjetos utilizando medios de montaje FluoShieldTM (Sigma-Aldrich). Las imágenes de fluorescencia se tomaron utilizando un microscopio KEYENCE (BZ-X800; KEYENCE).

Las células HeLa y N27-A se transfectaron con plásmido mRFP-GFP-LC3 (Addgene) en tándem utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en placas de 24 pocillos. Después de 24 h, las células se incubaron en medio de inanición (solución salina equilibrada de Earle, EBSS; Lonza) que contenía bafilomicina A1 (BafA1, 10 nM), CQ (20 µM) o 4A7C-301 (1 µM) durante 6 h y luego se fijaron. con 4% de formaldehído para la detección de fluorescencia. Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio KEYENCE y se contaron los puntos LC3 rojos (mRFP) y los puntos LC3 amarillos (mRFP+GFP) de tres pocillos independientes para cada grupo de tratamiento. Se seleccionaron al azar 10 células y se contaron de cada pocillo y se analizó un total de 30 células para cada grupo de tratamiento tanto en células HeLa como en células N27-A.

El pH lisosomal se detectó como se describió anteriormente61. Brevemente, después de la incubación en EBSS que contenía BafA1 (10 nM), CQ (20 µM) o 4A7C-301 (1 µM) durante 6 h, las células HeLa y N27-A se trataron con LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (5 µM; Life Technology) durante 45 min, seguido de 2 lavados en tampón HEPES (Gibco). Se tomaron inmediatamente imágenes de fluorescencia en longitudes de onda de excitación/emisión de 360/460 nm y 470/525 nm utilizando un espejo dicroico de 400 nm (KEYENCE). La relación de intensidades de fluorescencia (F360/470) se midió y calculó manualmente usando ImageJ para cada celda. El pH promedio de la medición de 5 células de cada uno de los tres pocillos para cada grupo de tratamiento en células HeLa y N27-A se calculó ajustando los valores de F360/470 a una curva de calibración de pH trazada con KCl/NaCl tamponado de pH 3,5 a 7,0 usando Prisma GraphPad (Versión 8.0.2).

El flujo autofágico se determinó mediante transferencia Western contra LC3B (1:1000; Cell Signaling, #2775) o SQSTM1/p62 (1:1000; Abcam, ab155686) de células recolectadas 0,5, 1, 2 y 4 h después de la inducción de la autofagia. Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ y se normalizaron frente a β-actina.

Se asignaron aleatoriamente ratones macho C57BL/6 J (8–10 semanas, 25–30 g; Jackson Laboratories) a 5 grupos que incluían vehículo (VEH), MPTP, MPTP + L-DOPA, MPTP + CQ y MPTP + 4A7C-301 ( n ≥ 7 para cada grupo). Se inyectó MPTP (Sigma-Aldrich) por vía intraperitoneal (ip) (30 mg/kg) durante 5 días (día 1-5). Primero se probaron diferentes dosis de CQ (20, 40 y 80 mg/kg) y 4A7C-301 (1, 5, 20 mg/kg) para determinar la ventana de dosis efectiva; luego, finalmente se seleccionaron dosis de 40 y 5 mg/kg. para CQ y 4A7C-301 respectivamente para mostrar los efectos más destacados. Se disolvió CQ o 4A7C-301 en PBS y se administró (ip) durante 16 días comenzando con la inyección de MPTP (día 1-16). Para evaluar el comportamiento discinético involuntario, se incluyó un grupo inyectado con L-DOPA, que recibió 50 mg/kg de L-DOPA y 15 mg/kg de benserazida (Sigma-Aldrich) (ip) durante 16 días (día 1-16). Todos los compuestos se administraron 6 h después de la inyección de MPTP para evitar cualquier efecto de los compuestos sobre el metabolismo de MPTP en el cerebro. Las pruebas de comportamiento motoras y no motoras se realizaron en los días siguientes, como se describe en la Fig. 4a, de forma ciega para el evaluador y el observador. El preentrenamiento y la configuración inicial para conductas relacionadas con el motor se realizaron 3 días antes de las inyecciones. Los ratones fueron sacrificados y sometidos a inmunohistoquímica. Los ratones se alojaron en las instalaciones de cuidado de animales del Hospital McLean en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad, temperatura ambiente y humedad. Los animales se manejaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital McLean (Protocolo #: 2015N000002) y siguieron las pautas de los Institutos Nacionales de Salud.

El Dr. Yoon Seong Kim de la Universidad de Florida Central proporcionó amablemente los virus adenoasociados (AAV) que expresan GFP únicamente o αSyn (de tipo salvaje o A53T). Se produjeron vectores de AAV recombinantes utilizando pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) modificado para expresar αSyn humano mutante y de tipo salvaje bajo el control del promotor de CMV. Las partículas virales (AAV2) se produjeron en el Viral Vector Core de la Universidad de Iowa de acuerdo con procedimientos operativos estándar (//medicine.uiowa.edu/vectorcore/). Se asignaron aleatoriamente ratones macho C57BL/6 (8-10 semanas, 25-30 g; Jackson Laboratories) a 7 grupos que incluían vector vacío (GFP) + VEH, αSyn de tipo salvaje (αSynWT) + VEH, αSyn mutante (αSynA53T) + VEH, αSynWT + CQ, αSynA53T + CQ, αSynWT + 4A7C-301 y αSynA53T + 4A7C-301 (n = 8 por grupo). Los vectores AAV se administraron unilateralmente en la sustancia negra mediante cirugía estereotáxica. Los ratones se anestesiaron usando una mezcla gaseosa de oxígeno e isoflurano (2,5% de inducción, 1,8% de mantenimiento) y los vectores de AAV se administraron en el hemisferio izquierdo (A/P -3,2 mm; M/L -1,4 mm; D/V - 4,5 mm) como una única inyección de 2 µl de 2,0 × 1012 partículas genómicas por ml (gp/ml) a una velocidad de 0,2 µl/min. La administración de CQ (40 mg/kg/día) o 4A7C-301 (5 mg/kg/día) se inició 4 semanas después de las inyecciones del vector AAV y continuó durante 5 semanas antes del sacrificio a las 8 semanas después de la cirugía.

Los ratones se entrenaron previamente en una unidad rotarod automatizada de 5 carriles (10 rpm, 3 min) durante 2 días y se midió la línea base (10 rpm, 90 s) antes de la prueba del rotarod (3 días antes de la inyección de MPTP o del primer rotarod). prueba en la semana 2). Las mediciones con Rotarod se realizaron utilizando un protocolo de aceleración, acelerado suavemente de 2 a 30 rpm durante 5 min. El tiempo en la varilla giratoria se midió automáticamente colocando un interruptor de disparo debajo del piso debajo del tambor giratorio.

Se entrenó a los ratones para que descendieran una varilla de metal vertical envuelta con cinta rugosa (80 cm de alto, 12 mm de diámetro) una vez al día durante 2 días, y luego se midió la línea de base antes de la prueba del poste (3 días antes de la inyección de MPTP o la primera prueba del poste). prueba en la semana 2). Se colocaron los ratones con la cabeza hacia arriba sobre el poste y se registró el tiempo total de descenso.

Los ratones se colocaron en un cilindro de plástico transparente (15,5 cm de alto, 12,7 cm de diámetro) con un espejo detrás. La actividad espontánea se registró y midió contando el número de eventos de crianza durante una sesión de 3 minutos. Se consideró una parte trasera solo cuando el ratón tocaba la pared del cilindro con las patas delanteras mientras estaba parado sobre las traseras (movimiento vertical) para contar movimientos fisiológicos significativos.

La prueba de discriminación olfativa fue diseñada con base en Prediger et al. 62. Brevemente, se colocaron ratones en una cámara (40 (w) × 20 (d) × 20 (h) cm) segmentada con dos compartimentos idénticos que contenían aserrín fresco (olor no familiar) en un lado y aserrín sin cambios (olor familiar) en un lado. ; mantenido durante 3 días antes de la prueba) en el otro lado. Los ratones podían elegir entre una u otra zona pasando libremente por una puerta abierta, durante 5 min. Los movimientos de los ratones se controlaron con EthoVision XT versión 7.0 (Noldus) y se registraron y analizaron el tiempo (s) y la distancia (cm) recorrida en cada compartimento.

Los movimientos involuntarios anormales (AIM) se calificaron utilizando la escala de calificación de discinesia en ratones desarrollada como se describe en Sebastianutto et al. 48. Brevemente, se grabaron 4 ratones simultáneamente con un sistema de seguridad Swann HD (B&H Photo-Video Inc.) durante 2 minutos por sesión, cada 20 minutos durante los 140 minutos posteriores a las inyecciones de fármacos (es decir, un total de 7 sesiones), cada dos minutos. o tercer día (Días 2, 4, 7, 9, 11, 13 y 16). Los movimientos discinéticos se calificaron para 3 subtipos de AIM básicos, incluidos los AIM axiales, de las extremidades anteriores y orolinguales, según la escala de gravedad de 0 a 4 que mide la duración de los AIM (0 = sin discinesia; 1 = muestra discinesia durante <50% de la observación). tiempo; 2 = muestra discinesia durante >50% del tiempo de observación; 3 = muestra discinesia durante todo el período de observación pero cesó ante estímulos externos; 4 = muestra discinesia continua e incesante). Para obtener una validación mejor y más sensible de la discinesia en ratones, incluimos una puntuación AIM de amplitud, que califica el grado de desviación de la posición de una parte del cuerpo o de un músculo desde su posición de reposo en una escala de 0 a 4, como se describió anteriormente8. Finalmente, la puntuación global de los AIM se calculó multiplicando las puntuaciones de los AIM básicos y de amplitud para cada subtipo en cada sesión. Los puntos de datos se representaron como el total general de la puntuación AIM individual en cada día de prueba.

Se cortaron tejidos cerebrales de ratón perfundidos en 30 µm de espesor utilizando un criostato Leica (CM 1950). Después de la incubación en solución de bloqueo (1% de suero de caballo (HS) y 0,3% de Triton X-100 en PBS (pH 7,4)), se incubaron secciones de cerebro con los siguientes anticuerpos primarios: TH (1:1000; Millipore, MAB318), Iba -1 (1:2000; Abcam, ab178846), Nurr1 (1:1000), fosfo-S129 (1:5000; ab51253), GFP (1:500; Aves Labs, GFP-1010). Para IHC, se utilizaron anticuerpos IgG anti-ratón biotinilados secundarios (1:200; Vector Laboratories, BA-2001) o anti-conejo (1:1000; BA-1100), seguidos de series de complejo de avidina-biotina (ABC; Vector Laboratories ) y reacciones de 3,3'-diaminobencidina (DAB; Sigma-Aldrich) según las instrucciones del fabricante. Para IF, se utilizaron anticuerpos secundarios anti-ratón Alexa Fluor® 568 (1:500; Life Technologies, A11031) y anti-pollo Alexa Fluor® 488 (1:500; Life Technologies, A11039). Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio KEYENCE y se cuantificaron como el número o la densidad óptica de células inmunorreactivas utilizando el software ImageJ.

El número de neuronas TH+ DA, neuronas NeuN+, células pS129 αSyn+ en el SN y microglía Iba-1+ en el SN y el cuerpo estriado se contaron estereológicamente en seis secciones coronales (30 µm de espesor) tomadas cada sexta sección (intervalos de 180 µm) para cada cerebro. Los límites del SN y el cuerpo estriado se delimitaron con un aumento bajo (4X) para estimar cada área total. Las células inmunorreactivas se contaron con imágenes tomadas con gran aumento (×40) por un investigador simple ciego. La media grupal del número total de células inmunorreactivas de cada cerebro se transformó como porcentaje del número en el grupo de control (%). Para los ratones inducidos por AAV-αSyn, la media del grupo del número total de células en el lado ipsilateral se transformó como un porcentaje del observado en el lado contralateral.

Los niveles de dopamina endógena en los extractos de tejido cerebral de ratones inyectados con MPTP o AAV-αSyn tratados con CQ o 4A7C-301 se determinaron utilizando un kit ELISA de dopamina para ratón (MyBiosource), como se describió anteriormente33. Para los ratones inducidos por MPTP, se utilizó el hemisferio izquierdo de cada grupo (n = 5) para el análisis y se comparó con el grupo tratado con vehículo (VEH). Para el modelo de ratón inyectado con AAV-αSyn, el lado inyectado con el vector viral (hemisferio izquierdo; ipsilateral) de cada grupo (n = 3) se comparó con el lado no inyectado (hemisferio derecho; contralateral).

Se administró por vía oral una dosis final de 2 mg/ml de 4A7C-301 disuelto en solución salina a ratas SD (machos, 7-9 semanas, n = 3 por grupo). Para medir la concentración de 4A7C-301 en el cerebro, las ratas fueron desangradas por completo para eliminar la sangre residual antes de la recolección del cerebro. Se recogieron muestras de cerebro y sangre a las 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 y 24 h después de la administración. Se desarrolló un método LC-MS/MS robusto con el límite inferior de cuantificación (LLOQ) de 1 ng/mL y 0,5 ng/mL para la cuantificación de 4A7C-301 en plasma y cerebro, respectivamente. La precisión de todas las muestras de control de calidad aceptadas de 4A7C-301 en niveles de concentración bajo, medio y alto cumplieron con los criterios de aceptación. Los cerebros aislados se homogeneizaron en PBS como una proporción de 1:3 entre el peso del cerebro (g) y el volumen de PBS (ml). Las concentraciones en serie deseadas de las soluciones de trabajo se lograron diluyendo la solución madre del analito con una solución de acetonitrilo al 50% en agua. Se agregaron 5 µl de soluciones de trabajo (5, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 5000 ng/ml) a 50 µl de homogeneizado de cerebro en blanco de rata SD macho para lograr estándares de calibración de 0,5 ~ 500 ng/ml (0,5 , 1, 2, 5, 10, 50, 100, 500 ng/ml) en un volumen total de 55 μl. Se prepararon cuatro muestras de control de calidad a 1,5 ng/ml, 3 ng/ml, 50 ng/ml y 400 ng/ml para el homogeneizado de cerebro, independientemente de las utilizadas para las curvas de calibración. Estas muestras de control de calidad se prepararon el día del análisis de la misma manera que los estándares de calibración. Se agregaron 55 µl de estándares, 55 µl de muestras de control de calidad y 55 µl de muestras desconocidas (50 µl de homogeneizado de cerebro con 5 µl de solución en blanco) a 200 µl de acetonitrilo que contenía una mezcla IS para precipitar proteínas, respectivamente. Luego las muestras se agitaron durante 30 segundos. Después de la centrifugación a 4 ˚C, 4000 xg durante 15 min, el sobrenadante se diluyó 5 veces con agua. Se inyectaron 25 µl de sobrenadante diluido en el sistema LC-MS/MS (AB API 5500 + instrumentos LC-MS/MS (n.º de serie EX224682008)) para análisis cuantitativo. Para medir la concentración de 4A7C-301 en el plasma, se obtuvieron muestras de suero de la sangre extraída y se analizaron mediante un sistema LC-MS/MS como se indicó anteriormente.

Se utilizó GraphPad Prism (Versión 8.0.2) para todos los análisis estadísticos y las pruebas específicas utilizadas se describen en las leyendas de las figuras. Los datos se compararon entre dos grupos o dentro de un grupo utilizando la prueba t de Student y entre varios grupos utilizando ANOVA de una o dos vías seguido de pruebas post hoc con comparaciones múltiples de Tukey, Dunnett o Bonferroni. Los datos se representan como media ± sem y se aceptó significación estadística para P <0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos están disponibles previa solicitud al autor correspondiente. Los datos originales se proporcionan con este documento.

de Lau, LM & Breteler, MM Epidemiología de la enfermedad de Parkinson. Lanceta Neurol. 5, 525–535 (2006).

Artículo PubMed Google Scholar

Tysnes, OB y ​​Storstein, A. Epidemiología de la enfermedad de Parkinson. J. Transmisión neuronal. (Viena) 124, 901–905 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Poewe, W. y col. Enfermedad de Parkinson. Nat. Rev. Dis. Imprimaciones 3, 17013 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Saijo, K. et al. Una vía Nurr1/CoREST en la microglía y los astrocitos protege a las neuronas dopaminérgicas de la muerte inducida por inflamación. Celda 137, 47–59 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pirooznia, SK, Rosenthal, LS, Dawson, VL y Dawson, TM Enfermedad de Parkinson: traducción de conocimientos de mecanismos moleculares a neuroprotección. Farmacéutico. Rev. 73, 33–97 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

González-Rodríguez, P. et al. La alteración del complejo mitocondrial I induce parkinsonismo progresivo. Naturaleza 599, 650–656 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fleming, A. et al. Las diferentes vías de degradación de la autofagia y la neurodegeneración. Neurona 110, 935–966 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weiss, JL, Ng, LK y Chase, TN Discinesia de larga duración inducida por levodopa. Lanceta 1, 1016-1017 (1971).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kang, UJ & Fahn, S. Manejo de la discinesia tardía. Ración de medicamentos Ther. 22, 1–7 (1988).

CAS PubMed Google Académico

Meissner, WG y cols. Prioridades en la investigación de la enfermedad de Parkinson. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 10, 377–393 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Obeso, JA et al. Piezas que faltan en el rompecabezas de la enfermedad de Parkinson. Nat. Medicina. 16, 653–661 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Arenas, E., Denham, M. y Villaescusa, JC Cómo crear una neurona dopaminérgica del mesencéfalo. Desarrollo 142, 1918-1936 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ferri, AL y cols. Foxa1 y Foxa2 regulan múltiples fases del desarrollo de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de una manera dependiente de la dosis. Desarrollo 134, 2761–2769 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Joksimovic, M. y col. El antagonismo Wnt de Shh facilita la neurogénesis de la placa del piso del mesencéfalo. Nat. Neurociencias. 12, 125-131 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chung, S. y col. Wnt1-lmx1a forma un nuevo bucle autorregulador y controla la diferenciación dopaminérgica del mesencéfalo de forma sinérgica con la vía SHH-FoxA2. Células madre celulares 5, 646–658 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zetterstrom, RH y cols. Agenesia de neuronas dopaminérgicas en ratones con deficiencia de Nurr1. Ciencia 276, 248–250 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kadkhodaei, B. y col. Nurr1 es necesario para el mantenimiento de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo adultas y en maduración. J. Neurosci. 29, 15923–15932 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moran, LB y cols. Análisis de las vías de alfa-sinucleína, dopamina y parkin en la nigra parkinsoniana confirmada neuropatológicamente. Acta Neuropathol. 113, 253–263 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Chu, Y. et al. Nurr1 en la enfermedad de Parkinson y trastornos relacionados. J.Comp. Neurol. 494, 495–514 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu, Y., Kompoliti, K., Cochran, EJ, Mufson, EJ y Kordower, JH Disminuciones relacionadas con la edad en la inmunorreactividad de Nurr1 en la sustancia negra humana. J.Comp. Neurol. 450, 203–214 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Evans, RM y Mangelsdorf, DJ Receptores nucleares, RXR y el Big Bang. Celda 157, 255–266 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A. y Perlmann, T. NURR1 en la enfermedad de Parkinson: desde la patogénesis hasta el potencial terapéutico. Nat. Rev. Neurol. 9, 629–636 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kim, CH y cols. Los agonistas del receptor nuclear Nurr1 mejoran sus funciones duales y mejoran los déficits de comportamiento en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 112, 8756–8761 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, CH, Leblanc, P. y Kim, KS Derivados de 4-amino-7-cloroquinolina para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson: implicaciones para el descubrimiento de fármacos. Opinión de expertos. Descubrimiento de drogas. 11, 337–341 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Muñoz-Tello, P. et al. Evaluación de ligandos NR4A que se unen y modulan directamente el receptor nuclear huérfano Nurr1. J. Med. Química. 63, 15639–15654 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Willems, S., Ohrndorf, J., Kilu, W., Heering, J. & Merk, D. Las cloroquinolineaminas en forma de fragmentos activan el receptor nuclear huérfano Nurr1 y aclaran los mecanismos de activación. J. Med. Química. 64, 2659–2668 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Willems, S. y col. Salto de andamios de amodiaquina a nuevos quimiotipos agonistas de Nurr1 a través de bibliotecas de análogos a microescala. ChemMedChem 17, e202200026 (2022).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Nirk, EL, Reggiori, F. & Mauthe, M. Hidroxicloroquina en trastornos autoinmunes reumáticos y más. EMBO Mol. Medicina. 12, e12476 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manohar, S., Khan, SI y Rawat, DS Síntesis, actividad antipalúdica y citotoxicidad de conjugados de 4-aminoquinolina-triazina. Bioorg. Medicina. Química. Letón. 20, 322–325 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Manohar, S., Khan, SI y Rawat, DS Síntesis de híbridos de 4-aminoquinolina-1,2,3-triazol y 4-aminoquinolina-1,2,3-triazol-1,3,5-triazina como posibles agentes antipalúdicos . Química. Biol. Desdrogas. 78, 124-136 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Manohar, S., Rajesh, UC, Khan, SI, Tekwani, BL y Rawat, DS Nuevos híbridos basados ​​en 4-aminoquinolina-pirimidina con actividad antipalúdica in vitro e in vivo mejorada. ACS Med. Química. Letón. 3, 555–559 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Manohar, S., Khan, SI y Rawat, DS Híbridos a base de 4-aminoquinolina-triazina con actividad antipalúdica in vitro mejorada contra cepas de Plasmodium falciparum sensibles y resistentes a CQ. Química. Biol. Desdrogas. 81, 625–630 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rajan, S. y col. PGE1 y PGA1 se unen a Nurr1 y activan su función transcripcional. Nat. Química. Biol. 16, 876–886 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhan, Y. et al. La citosporona B es un agonista del receptor nuclear huérfano Nur77. Nat. Química. Biol. 4, 548–556 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhou, W., Hurlbert, MS, Schaack, J., Prasad, KN y Freed, CR La sobreexpresión de alfa-sinucleína humana provoca la muerte de neuronas dopaminérgicas en cultivos primarios de ratas y en células inmortalizadas derivadas del mesencéfalo. Res. cerebral. 866, 33–43 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gao, L., Zhou, W., Symmes, B. y Freed, CR Reclonación de la línea celular de DOpamina N27 para mejorar un modelo de cultivo celular de la enfermedad de Parkinson. MÁS UNO 11, e0160847 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, TY y cols. La cloroquina modula las respuestas inflamatorias autoinmunes a través de Nurr1 en enfermedades autoinmunes. Ciencia. Rep. 9, 15559 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Choi, HK, Won, L., Roback, JD, Wainer, BH y Heller, A. Modulación específica de la expresión de dopamina en células híbridas neuronales por células primarias de diferentes regiones del cerebro. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 89, 8943–8947 (1992).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le, W. y col. Disminución de la expresión del gen NURR1 en pacientes con enfermedad de Parkinson. J. Neurol. Ciencia. 273, 29–33 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin, X. y col. La expresión condicional de la alfa-sinucleína mutante relacionada con la enfermedad de Parkinson en las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo provoca una neurodegeneración progresiva y la degradación del receptor nuclear del factor de transcripción relacionado 1. J. Neurosci. 32, 9248–9264 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Decressac, M. y col. La regulación negativa de Nurr1 inducida por alfa-sinucleína interrumpe la señalización de GDNF en las neuronas de dopamina nigral. Ciencia. Traducción Medicina. 4, 163ra156 (2012).

Artículo PubMed Google Scholar

Mauthe, M. y col. La cloroquina inhibe el flujo autofágico al disminuir la fusión autofagosoma-lisosoma. Autofagia 14, 1435-1455 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiao, S. y col. La amodiaquina, un antipalúdico, provoca un bloqueo autofágico-lisosomal y proliferativo que sensibiliza a las células de melanoma humano a la muerte celular inducida por el hambre y la quimioterapia. Autofagia 9, 2087-2102 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubinsztein, DC, Codogno, P. & Levine, B. La modulación de la autofagia como posible objetivo terapéutico para diversas enfermedades. Nat. Rev. Droga. Descubrimiento. 11, 709–730 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimura, S., Noda, T. y Yoshimori, T. Disección del proceso de maduración del autofagosoma mediante una nueva proteína informadora, LC3 marcada con fluorescencia en tándem. Autofagia 3, 452–460 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Homewood, CA, Warhurst, DC, Peters, W. & Baggaley, VC Lisosomas, pH y acción antipalúdica de la cloroquina. Naturaleza 235, 50–52 (1972).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Doty, RL Disfunción olfativa en enfermedades neurodegenerativas: ¿existe un sustrato patológico común? Lanceta Neurol. 16, 478–488 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Sebastianutto, I., Maslava, N., Hopkins, CR y Cenci, MA Validación de una escala mejorada para calificar la discinesia inducida por l-DOPA en el ratón y los efectos de antagonistas específicos del receptor de dopamina. Neurobiol. Dis. 96, 156-170 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mitsumoto, Y., Watanabe, A., Mori, A. y Koga, N. Regeneración espontánea de neuronas dopaminérgicas nigroestriatales en ratones C57BL/6 tratados con MPTP. Bioquímica. Biofísica. Res. Comunitario. 248, 660–663 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Petroske, E., Meredith, GE, Callen, S., Totterdell, S. y Lau, YS Modelo de parkinsonismo en ratón: una comparación entre el tratamiento con MPTP subagudo y el tratamiento crónico con MPTP/probenecid. Neurociencia 106, 589–601 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wada, M. y col. Caracterización del comportamiento en el modelo de ratón MPTP/p de la enfermedad de Parkinson. J. Integral. Neurociencias. 20, 307–320 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P. y Bjorklund, A. Cambios neurodegenerativos y de comportamiento progresivos inducidos por la sobreexpresión de alfa-sinucleína mediada por AAV en neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo. Neurobiol. Dis. 45, 939–953 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Gorbatyuk, OS et al. El estado de fosforilación de Ser-129 en la alfa-sinucleína humana determina la neurodegeneración en un modelo de enfermedad de Parkinson en ratas. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 105, 763–768 (2008).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Willems, S. & Merk, D. Química medicinal y biología química de los moduladores Nurr1: una estrategia emergente en la neurodegeneración. J. Med. Química. 65, 9548–9563 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Karpowicz, RJ Jr et al. Las imágenes selectivas de semillas de alfa-sinucleína proteopáticas internalizadas en neuronas primarias revelan una visión mecanicista de la transmisión de sinucleinopatías. J. Biol. Química. 292, 13482–13497 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fornai, F., Alessandri, MG, Torracca, MT, Bassi, L. y Corsini, GU Efectos de las lesiones noradrenérgicas sobre la cinética de MPTP/MPP+ y el agotamiento de dopamina nigroestriatal inducido por MPTP. J. Farmacol. Exp. El r. 283, 100-107 (1997).

CAS PubMed Google Académico

Martín-López, E. et al. La patología de la alfa-sinucleína y la neurogénesis reducida en el sistema olfativo afectan el olfato en un modelo de ratón con enfermedad de Parkinson. J. Neurosci. 43, 1051-1071 (2023).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Uemura, N. y col. La alfa-sinucleína diseminada desde el bulbo olfatorio provoca hiposmia, ansiedad y pérdida de memoria en ratones BAC-SNCA. Mov. Desorden. 36, 2036-2047 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leblanc, P. et al. Producción de anticuerpos policlonales específicos de Nurr-1 libres de reactividad cruzada contra sus homólogos cercanos, Nor1 y Nur77. J. Vis. Exp. 102, e52963 (2015).

Kim, W. y col. miR-126 contribuye a la enfermedad de Parkinson al desregular la señalización del factor de crecimiento similar a la insulina/fosfoinositida 3-quinasa. Neurobiol. 35 años, 1712-1721 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, L., Ouyang, Q., Werthmann, GC, Thompson, HM & Morrow, EM Microscopía de células vivas y medición del pH luminal basada en fluorescencia en orgánulos intracelulares. Frente. Desarrollo celular. Biol. 5, 71 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Prediger, RD y cols. La administración intranasal única de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina en ratones C57BL/6 modela la fase preclínica temprana de la enfermedad de Parkinson. Neurotox Res. 17, 114-129 (2010).

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (NS127391 y OD024622; a K.-SK), el Fondo de Investigación de Terapia Celular de Parkinson en el Hospital McLean (a K.-SK) y por la subvención de SERB (Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería) (EMR/2014 /001127; a DSR) del gobierno de la India. DSR también agradece a USIC-CIF, Universidad de Delhi, por los datos analíticos de compuestos químicos.

Estos autores contribuyeron igualmente: Woori Kim, Mohit Tripathi.

Departamento de Psiquiatría, Hospital McLean, Facultad de Medicina de Harvard, Belmont, MA, 02478, EE. UU.

Woori Kim, Chunhyung Kim, Young Cha, Melissa Feitosa, Eric Sah, Yehan Kim, Sanghyeok Ko, Kaiya Bhatia, Young-Bin Kong, Bruce Cohen y Kwang-Soo Kim

Laboratorio de Neurobiología Molecular, Programa de Neurociencia, Hospital McLean, Facultad de Medicina de Harvard, Belmont, MA, 02478, EE. UU.

Woori Kim, Chunhyung Kim, Young Cha, Melissa Feitosa, Eric Sah, Yehan Kim, Sanghyeok Ko, Kaiya Bhatia, Young-Bin Kong y Kwang-Soo Kim

Departamento de Química, Universidad de Delhi, Delhi, 110007, India

Mohit Tripathi, Satyapavan Vardhineni, Shamseer Kulangara Kandi, Rohit Kholiya, Anuj Thakur, Sunny Manohar, Gagandeep Sindhu y Diwan S. Rawat

Instituto de Terapéutica Neurológica, Universidad de Rutgers, Piscataway, Nueva Jersey, 08854, EE. UU.

Yoon Seong Kim

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WK, MT, DSR y K.-SK diseñaron el estudio. WK realizó la mayoría de los experimentos y análisis. MT, SV, SKK, RK, AT, SM y GS realizaron y confirmaron procedimientos sintéticos. CK estableció sistemas de ensayo de alto rendimiento. YC realizó un ensayo de actividad mitocondrial. SK generó lentivirus. MF, ES, Y.-BK, YK y KB contribuyeron a los experimentos in vivo. Y.-SK proporcionó vectores AAV. Y.-SK y BC aportaron aportaciones intelectuales. WK, MT, DSR y K.-SK escribieron el manuscrito, con debates y comentarios de todos los coautores.

Correspondencia a Diwan S. Rawat o Kwang-Soo Kim.

WK, MT, SV, SKK, RK, AT, DSR y K.-SK son coinventores de una solicitud de patente de utilidad estadounidense pendiente n. 18/013,155 que está asignado a McLean Hospital Corporation y la Universidad de Delhi. La solicitud de patente núm. 18/013,155 describe y reivindica compuestos que incluyen SPV-94 (4A7C-301) que se describen en este manuscrito y métodos para usar estos compuestos para tratar enfermedades neurodegenerativas. K.-SK es cofundador de NurrOn Pharmaceutical, Inc., que tiene derechos para desarrollar los compuestos descritos en este manuscrito en virtud de un acuerdo de licencia con The McLean Hospital Corporation. El resto de autores no tienen conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Michael Henderson y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Kim, W., Tripathi, M., Kim, C. et al. Un agonista optimizado de Nurr1 proporciona efectos modificadores de la enfermedad en modelos de enfermedad de Parkinson. Nat Comuna 14, 4283 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39970-9

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Recibido: 29 de diciembre de 2022

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 18 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39970-9

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